[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101580831A [43]公开日2009年11月18日
[21]申请号200810037428.8[22]申请日2008.05.15
[21]申请号200810037428.8
[71]申请人中国科学院上海生命科学研究院
地址200031上海市岳阳路320号
[72]发明人孙兵 王茜 [74]专利代理机构上海专利商标事务所有限公司代理人范征
[51]Int.CI.C12N 15/10 (2006.01)C12N 15/11 (2006.01)
权利要求书 2 页 说明书 22 页 附图 1 页
[54]发明名称
及其引物
[57]摘要
本发明公开了一种特别适合于扩增单克隆抗体
重链基因的引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1或
SEQ ID NO：2所示的序列。所述的引物适用于多种
类型的单克隆抗体重链可变区的扩增，包括IgG1，
IgG2a，IgG2b等抗体亚型。本发明还公开了一种获
得单克隆抗体重链基因的方法。
200810037428.8权 利 要 求 书第1/2页 1.一种获得单克隆抗体重链基因的方法，其特征在于，所述方法包括： (1)以SEQ ID NO：1所示序列为引物，以杂交瘤细胞的RNA为模板，进行反转录，获得cDNA；
(2)在反转录获得的cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；
(3)以SEQ ID NO：2所示序列和多聚M为引物，以加尾产物为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；其中M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数是10-40个；和
(4)从扩增产物中分离获得单克隆抗体重链基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，N是选自C或G的碱基。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR扩增的热循环过程中，退火温度是60-65℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：对获得的抗体重链基因进行测序，从而获得单克隆抗体重链基因的序列。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体是：IgG1，IgG2a或IgG2b型。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单克隆抗体重链基因包括抗体重链的前导序列和可变区基因。
7.一种用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，其特征在于，所述的引物具有选自下组的序列：SEQ ID NO：1所示的序列，或SEQ ID NO：2所示的序列。
8.一种扩增单克隆抗体重链基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有引物，所述的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列和SEQ ID NO：2所示的序列。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有：同聚物加尾试剂，用于在反转录产物中cDNA的3’末端加上多聚N，获得加尾产物；其中N是选自A、T、C或G之一的碱基，N的个数是5-120个；和/或 多聚M引物，M是选自A、T、C或G之一且与N互补配对的碱基，M的个数
200810037428.8权 利 要 求 书 第2/2页
是10-40个。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有： PCR扩增试剂；和/或
RNA提取试剂；和/或
使用说明书。
200810037428.8说 明 书第1/22页扩增抗体重链前导序列及可变区基因序列的方法及其引物
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种扩增重链前导序列及可变区基因序列的方法及引物。
背景技术
单克隆抗体作为一种新型生物制剂在人类疾病的预防、诊断和方面已显示出重要的作用。但是由于单克隆抗体大都来自于鼠源，鼠源性单抗属于异种蛋白而具有免疫原性，故在人体内产生不同程度的人抗鼠抗体(H A M A)反应，从而削弱其的有效性，并对清除抗体的器官产生损害。并且在人体中常不能有效地活化补体和F c受体相关的效应系统，因此其在人体内重复应用具有一定局限性。为了克服这些鼠源单抗的缺点，基因工程抗体技术应运而生。它是在基因水平上，对抗体进行改造，或者构建完全新型的抗体。基因工程抗体主要包括嵌合抗体，人源化抗体及一些小分子抗体，如F a b，s c F v等。 嵌合抗体是人源化抗体的最早形式。在嵌合抗体的构建过程中，准确地克隆鼠抗体的信号肽和可变区基因是最为重要的。在B细胞发育过程中重链可变区基因首先重排，然后是轻链可变区基因。最后每个B细胞
只含有一个功能性重链可变区D N A序列和一个轻链可变区D N A序列，每个这样的B细胞产生一种特异性抗体。重链可变区基因重排包括D-J重排和V-D J重排两个独立的过程，可有8262种组合；轻链可变区基因的重排包括V-J重排，可有320种组合。因此，相对于轻链可变区来说，重链可变区的多样性更高，扩增的难度更大。 近年来，由于分子生物学技术的发展，P C R技术已被广泛用于克隆V H或V L基因。根据小鼠I g重链和轻链V区基因5’端及3’端相对保守的特点，可以设计相应的引物通过反转录P C R来扩增重链及轻链的相应功能区。目前，根据5’端引物配对的位置不同，扩增鼠抗体可变区基因的简并引物设计方式主要分为两种：一种是抗体重链和轻链V区5’端引物与V区的前导序列互补，重链V区3’
200810037428.8说 明 书 第2/22页端引物与IgG CH15’端及所有V区J段3’端互补，轻链V区3’端引物与κ链CL5’端和轻链V区的所有J段3’段互补；另一种引物分别与抗体可变区基因骨架区F R1和F R4互补。上述第一种引物的简并性基本不会造成P C R产物与原基因序列上氨基酸的差异，但由于前导序列变化较大，引物设计难度高，往往得不到所需的扩增产物；而第二种引物因为其简并性，有可能造成抗体氨基酸的变异或缺失，这种差异可能会导致构建的嵌合抗体的亲和力等功能的降低。由于目前抗体基因库的资料有限，因此这些比较常见的引物可能不适用于扩增一些特殊单抗的基因。
鉴于以上问题，近年来出现的R A C E技术具有省时、灵敏和高效的特点。RACE(rapid amplification cDNA end)即cDNA克隆法或快速扩增cDNA末端法。5’R A C E是以P C R技术为基础，使用O l i g o(d T)对m R N A进行反转录后，再用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(T d T)给c D N A的5’端进行同聚物加尾反
应，从而在未知的cDNA的5’端加上一段linker，然后再用基因特异引物和linker引物经PCR扩增未知m R N A的5’端。采用5’R A C E的方法可以得抗体的可变区及信号肽的真实序列，继而保证通过基因工程改造得到的抗体的功能。然而要成功应用这种方法还有许多技术上的难题。首先，在3个连续的酶促反应(反转录、T d T加尾、P C R 扩增)步骤中，每一个步骤的失败都会导致实验完全或部分失败；其次，即使3个酶促反应均能顺利进行，但其结果也通常会出现一些非特异产物或非全长的产物背景，对基因特异引物的设计要求很高。随着R A C E技术日益完善，目前己有商业化R A C E技术产品推出，其中以C L O N T E C H的M a r a t h o T M技术和S M A R T T M R A C E技术为代表。但是这些商业化的产品的操作繁琐，实验周期较长，而且成本高昂，成功率也不很理想，均不太适合用来扩增抗体的可变区序列。
因此，本领域迫切需要开发操作简便、成本低廉、效果优异的扩增抗体可变区序列的方法及产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获得单克隆抗体重链基因的方法，所述方法适用于多种类型的单克隆抗体的重链扩增，操作简便，成本低廉。
本发明的另一目的在于提供用于扩增单克隆抗体重链基因的引物，以及含有所述引物或其它相关试剂的试剂盒。
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