[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101148651A [43]公开日2008年3月26日
[21]申请号200710121453.X [22]申请日2007.09.06
[21]申请号200710121453.X
[71]申请人中国科学院微生物研究所
地址100080北京市海淀区中关村北一条13号
[72]发明人东秀珠 蔡世淳 张科贵 [74]专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司代理人关畅
[51]Int.CI.C12N 1/20 (2006.01)C12P 1/04 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 12 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种梭菌及其培养方法与应用。
保藏号为CGMCCNo.2125。本发明所提供的居瘤胃梭
包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、木聚糖酶、甘
露聚糖酶、酯酶、果胶酸酶。与已发现的解纤维梭
菌相比，本发明中的居瘤胃梭菌H1除具有分解天然
纤维素的能力外，还具有分解其中酯的酯酶活性；
与热纤维梭菌相比，居瘤胃梭菌H1中温(39℃)生长，
易培养，并具有利用戊糖的能力。本发明中的居瘤
胃梭菌H1在纤维素降解工业中将有广阔的应用前景。
200710121453.X权 利 要 求 书第1/1页
1.居瘤胃梭菌(C l o s t r i d i u m r u m i n o c o l u m)H1 C G M C C N o.2125。
2.权利要求1所述居瘤胃梭菌H1 CGMCC No.2125的培养方法，是将居瘤胃梭菌H1 C G M C C N o.2125接种于R C培养基，在25-45℃、p H6-10的条件下进行培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述R C培养基，在1000m l 中含有：瘤胃液，200-600ml；无机盐溶液I，100-200ml；无机盐溶液II，100-200ml；碳源物质，1-4g；氮源物质，0.3-1.0g；余量为水；
所述无机盐溶液I是浓度为0.2-0.4％的K2HPO4溶液；
所述无机盐溶液II为含0.2-0.4％KH2PO4、0.4-0.8％(NH4)2SO4、0.4-0.8％NaCl、0.04-0.08％MgSO4、0.04-0.08％CaCl2的水溶液；
所述百分含量均为质量百分含量。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述碳源物质为纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖和乳糖中的一种或几种。
5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于：所述氮源物质为半胱氨酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种。
6.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于：所述R C培养基中还含有5-15g的NaHCO3。
7.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于：所述R C培养基中还含有0.2-0.6mg的刃天青。
8.根据权利要求2或3或4所述的培养方法，其特征在于：所述培养温度为35-41℃。
9.根据权利要求2或3或4所述的培养方法，其特征在于：所述pH为6.5-7.5。
10.权利要求1所述居瘤胃梭菌H1 CGMCC No.2125在降解纤维素类物质中的应用。
200710121453.X说 明 书第1/12页
一种梭菌及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及微生物领域中的一种梭菌及其培养方法与应用。
背景技术
植物通过光合作用生成有机物，其中35％或更多以作物秸秆等纤维素类物质形式存在，但是这类纤维素类物质目前还没能被充分开发利用，因而又成为重要的环境污染源。纤维素类物质能被降解为五碳糖、六碳糖，然后糖可通过微生物发酵产生燃料酒精或其它化工产品原料。因此人们一直在探索研究将纤维素类废弃物转化为可再生能源。目前一般是用化学或物理方法水解纤维素产生糖，再用生物发酵糖产生燃料乙醇，但此种技术成本高，一直没有大规模产业化。用微生物细胞及纤维素酶来降解纤维素可以提高降解效率，降低成本。因而寻高效的微生物细胞或纤维素酶应用于纤维素降解工业，将会对促进纤维素类物质转化为可再生资源有重要的意义。
瘤胃作为反刍动物的消化器官，是迄今已知的、降解转化纤维素类物质效率最高的天然体系，它依赖于瘤胃微生物体的协同作用将天然纤维类物质快速降解转化成一系列动物营养和能源物质。可以认为瘤
胃是一个完美的、天然的秸秆纤维降解消化加工厂和高效厌氧发酵罐，目前尚没有任何人工系统能与之媲美。 目前报道的能降解纤维素的梭菌有：解纤维梭菌，分离自土壤，具有分解纤维素的能力，但不具有酯酶活性(Petitdemange，E.，F.Caillet，J.Giallo，and C.Gaudin.1984.Clostridium v.，a cellulolytic，m e s o p h i l i c s p e c i e s f r o m d e c a y e d g r a s s.I n t.J.S y s t.B a c t e r i o l. 34：155-159)；热纤维梭菌，分离自土壤，高温(58℃)生长，具有分解纤维素的能力，但不能利用其中的木聚糖和木糖(Johnson EA，Sakajoh M，Halliwell G，Madia A，Demain AL.1982.Saccharification of Complex Cellulosic Substrates by the Cellulase System from Clostridium thermocelium.Appl Environ Microbiol.43(5)：1125-1132)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种梭菌，该梭菌具有降解纤维素及木聚糖、木糖和
酯类物质的活性。
本发明所提供的梭菌，被鉴定为居瘤胃梭菌Clostridium ruminocolum，来源于牦牛瘤胃内容物。
所述居瘤胃梭菌具体为居瘤胃梭菌(Clostridium ruminocolum)H1，它于2007年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址是中国北京市朝阳区大屯路甲3号，保藏号为CGMCC No.2125。
本发明所提供的居瘤胃梭菌H1具有以下特征：
1)菌落特征：菌落直径为1.0-2.0mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，黄或白。
2)细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染阴性；细胞直径0.8-1.0μm。
3)生理生化特征：厌氧生长；接触酶阴性；不产吲哚；脲酶阴性；不水解七叶灵；不液化明胶；不产生H2S；不还原硝酸盐；VP试验阴性；能利用纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖、乳糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、糖原、丙酮酸、蔗糖、海藻糖、淀粉、苦杏仁苷、赤藓糖醇、甘油、肌醇、乳酸、甘露醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、水杨苷、马尿酸；可以利用铵盐作为氮源。
4)居瘤胃梭菌H1的16S rRNA基因序列长度为1547bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示。
本发明的另一个目的是提供一种培养居瘤胃梭菌H1的方法。
本发明所提供的培养居瘤胃梭菌H1的方法，是将居瘤胃梭菌H1接种于R C培养基，在25-45℃、pH 6-10的条件下培养。
在1000m l上述R C培养基中含有：瘤胃液，200-600m l；无机盐溶液I，100-200ml；无机盐溶液II，100-200ml；碳源物质，1-4g；氮源物质，0.3-1.0g；余量为水。
其中，所述无机盐溶液I是浓度为0.2-0.4％的K2HPO4溶液；所述无机盐溶液II为含0.2-0.4％KH2PO4、0.4-0.8％(NH4)2SO4、0.4-0.8％NaCl、0.04-0.08％MgSO4、0.04-0.08％CaCl2的水溶液。所述百分含量均为质量百分含量。
其中，碳源物质可以选自纤维二糖、纤维素、麦芽糖、木糖、木聚糖和乳糖中的一种或几种，氮源物质可以为半胱氨酸盐酸盐和铵盐中的一种或几种，具体可以根据实际情况而定。
为了使R C培养基维持在一个比较稳定的p H值范围内，还要向培养基中加入5-15g的NaHCO3。
上述R C培养基还包括氧化还原指示剂，具体可为刃天青，其含量可为0.2-0.6mg。
本发明培养方法中，所需的厌氧环境是通过注入CO2气体得到的，一般注入达到1大气压的量。其中，最适培养温度为35-41℃，最适p H为6.5-7.5。 本发明所提供的居瘤胃梭菌H1易培养，培养效率高，可达2.5±1g/L。 本发明的居瘤胃梭菌H1是从牦牛的瘤胃中分离得到的，是一种能够降解纤维素及木聚糖、木糖和酯类的微生物。该微生物中含有降解纤维素的复合酶系，包括外切纤维素酶、内切纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、酯酶、果胶酸酶，酶活分别为为4.1±1.19U/mg、118.7±4.5U/mg、167.36±22.9U/mg、45.9±3.52U/mg、4±0.5U/mg、35.3±1.77U/mg。与解纤维梭菌相比，本发明中的居瘤胃梭菌H1除具有分解天然纤维素的能力外，还具有分解其中酯的酯酶活性；与热纤维梭菌相比，居瘤胃梭菌H1中温(39℃)生长，易培养，并具有利用戊糖的能力。通过对本发明居瘤胃梭菌H1参与纤维素
类物质降解的酶系的研究，探索利用其细胞或纤维素酶建立纤维素类物质高效转化系统，可以为实现纤维素类物质高效利用提供技术支持。因此本发明中的居瘤胃梭菌H1在降解纤维素类物质中将能够得到广泛应用，在纤维素降解工业中会有广阔的应用前景。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。 实验中所使用的RC液体培养基的基本组成为(/升)：
瘤胃液：400ml；无机盐溶液I：150ml；无机盐溶液II：150ml；纤维二糖：2.5g；半胱氨酸盐酸盐：0.5g；刃天青：0.4mg；NaHCO3：10g；蒸馏水定容至1000ml。 无机盐溶液I：质量百分比浓度为0.3％的K2HPO4溶液。
无机盐溶液II：含0.3％KH2PO4、0.6％(NH4)2SO4、0.6％NaCl、0.06％MgSO4、0.06％CaCl2的水溶液。
所述百分含量均为质量百分含量。
实验中所使用的RC固体培养基是向上述RC液体培养基中加入15g琼脂，使其终浓度为1.5％。
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