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一种基于TLR7激动剂偶联肽的新型冠状病毒纳米乳疫苗及其制备

一种基于tlr7激动剂偶联肽的新型冠状病毒纳米乳疫苗及其制备
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及一种基于tlr7激动剂偶联肽的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗的制备及其在预防冠状病毒sars-cov-2野毒株和突变株感染中的应用。

背景技术：

2.严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)，是一种具有包膜的正链单股rna病毒，属于冠状病毒科乙型冠状病毒属严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒种。该病毒的宿主包括哺乳动物和禽类动物，是导致2019冠状病毒病(covid-19)的病原体。截至2021年4月7日，全球已有192个国家和地区累计报告逾1.32亿名确诊病例，其中逾287.3万人死亡、7,522.1万人治愈，目前数字仍在迅速攀升中。病毒迅速传播的同时也在发生变异。在抗击covid-19的紧迫形势下,多肽疫苗有望为疫苗的开发和研制节省时间和成本。
3.与减毒疫苗和灭活疫苗相比，病毒抗原表位多肽疫苗更适用于应对病毒的变异；能达到快速、高效生产的要求，降低疫苗制作的成本；疫苗中无完整的病毒结构，安全性较高。但是与传统的灭活或活体疫苗相比，由基因工程重组抗原或化学合成多肽组成的现代疫苗往往存在免疫原性弱等问题，因此免疫佐剂是合成多肽疫苗制剂中的重要组成部分。
4.疫苗中的佐剂可有效增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫反应的类型。目前已研发和批准上市了多种疫苗佐剂包括铝佐剂、乳剂、脂质体、病毒体等。铝佐剂是应用最广泛的免疫佐剂，可作为“抗原库”，缓慢释放抗原，延长免疫刺激效果，同时促进注射部位巨噬细胞的应答。另外，乳剂型佐剂研发历史悠久，目前主要用于流感、利仕曼病、疟疾等疫情的储备佐剂，迄今已应于用30多个国家。与铝佐剂的作用机制不同乳剂型免疫佐剂主要以间接方式递送抗原，它可增强抗原递呈细胞(apc)的对抗原物质的吞噬及胞饮作用，刺激单核细胞、巨噬细胞、粒细胞分泌ccl2、cxcl8、ccl3和ccl4等因子，并促进单核细胞向dc分化。乳剂佐剂不是直接以dc为靶标增强抗原摄取，而是介导其上游的dc前体细胞募集及其后续的分化来发挥佐剂作用。近来的研究发现乳剂佐剂还能将抗原从注射位点引流到淋巴结，与免疫细胞激发反应从而极大地提高免疫应答，产生更高水平的保护性抗体。
5.前期研究显示铝佐剂与高纯度的小分子蛋白抗原共同使用时存在激发细胞免疫应答能力不足的问题，不适用于多肽疫苗的开发。而基于角鲨烯的水包油型纳米乳剂可增加抗原的稳定性，有利于降低疫苗剂量或抗原浓度，还可以增强细胞免疫应答。
6.已批准上市的角鲨烯的水包油型纳米乳剂，如mf-59
tm
、as03，处方设计不利于covid-19多肽抗原发挥最佳的免疫应答效应。专利文献cn201010247976.0公开了一种含角鲨烯、聚醚、聚氧乙烯蓖麻油的亚微乳佐剂，但聚氧乙烯蓖麻油在注射给药中具有较大毒性，易引起变态反应、中毒性肾损伤、神经毒性、心脏血管毒性等。专利文献cn200910193930.2公开了一种水包油型复方疫苗佐剂，但其中的蜂胶组成复杂，含多种不
明成分，且制备过程需要用到70％乙醇，易造成溶剂残留，仅适用于兽用疫苗。
7.因此，本领域迫切需要研发更为安全有效的人用新型佐剂，配合tlr7激动剂偶联肽发挥作用，并且需要制备快速简便，可在短期内实现大规模生产用于应对突发疫情。

技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种基于tlr7激动剂偶联肽的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗及其制备方法。
9.本发明的第一方面，提供了一种冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂，所述疫苗制剂包含：
10.(a)冠状病毒sars-cov-2疫苗多肽，所述疫苗多肽包括抗原多肽以及任选地与所述抗原多肽偶联的tlr7激动剂；
11.(b)佐剂，所述佐剂是基于角鲨烯的水包油型纳米乳剂；和
12.(c)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
13.在另一优选例中，所述佐剂包含以下组分：角鲨烯1-15％(w/w)，α-生育酚0-15％(w/w)，乳化剂0.1-10.0％(w/w)，和嵌段共聚物0.005-10％(w/w)，按所述制剂的总重量计。
14.在另一优选例中，所述佐剂还包含水相介质。
15.在另一优选例中，所述佐剂包含油相部分和水相部分。
16.在另一优选例中，所述佐剂的油相部分包含：角鲨烯1-15％(w/w)，α-生育酚0-15％(w/w)，和乳化剂0.1-10.0％(w/w)；所述佐剂的水相部分包含：嵌段共聚物0.005-10％(w/w)和水相介质，按所述制剂的总重量计。
17.在另一优选例中，所述佐剂包含角鲨烯1-5％(w/w)，较佳地2-2.5％(w/w)。
18.在另一优选例中，所述佐剂包含α-生育酚0-5％(w/w)，较佳地2.5-4％(w/w)。
19.在另一优选例中，所述佐剂包含乳化剂1-5％(w/w)，较佳地1-2％(w/w)。
20.在另一优选例中，所述佐剂包含嵌段共聚物0.01-5％(w/w)，较佳地0.01-0.5％(w/w)。
21.在另一优选例中，所述角鲨烯来源于鲨鱼肝脏(特别是同齿刺鲨鱼、喙吻田氏鲨、南方乌鲨等)、橄榄油、棕榈油、麦胚油和/或酵母等。
22.在另一优选例中，所述乳化剂选自下组：磷脂、聚山梨酯类、蔗糖酯、柠檬酸脂肪酸甘油酯类、脂肪酸甘油脂类、脂肪酸山梨坦类、环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚乙二醇、甲壳质、甲壳胺、胆酸及其盐类、或其组合。
23.在另一优选例中，所述乳化剂选自下组：磷脂、聚山梨酯、或其组合。
24.在另一优选例中，所述乳化剂包括聚山梨酯80。
25.在另一优选例中，所述乳化剂包括聚山梨酯80和磷脂的组合。
26.在另一优选例中，所述嵌段共聚物为医用嵌段共聚物。
27.在另一优选例中，所述嵌段共聚物的数均分子量或重均分子量为300-200000，较佳地500-100000。
28.在另一优选例中，所述嵌段共聚物选自下组：甲氧基聚乙二醇-聚己内酯、甲氧基聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸-聚乙烯亚胺、聚乳酸-聚乙二醇、聚磷酸酯两嵌段共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌
段共聚物、或其组合。
29.在另一优选例中，所述嵌段共聚物选自下组：甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl，peg:350、550、750、1000、3400、5000、10000、20000；pcl：2000、5000)，甲氧基聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸(mpeg-plga，peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000；plga：1000、2000、5000、10000、15000、20000、40000)，聚乳酸羟基乙酸-聚乙烯亚胺(plga-pei，plga：1000、2000、5000、10000、15000、20000、40000；pei:600、1800、10000、70000)，聚乳酸-聚乙二醇(pla-peg，pla：2000、5000；peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000)，聚磷酸酯两嵌段共聚物(pcl-b-phep，peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(泊洛沙姆188等)，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(peo-ppo-peo)，或其组合。
30.在另一优选例中，所述嵌段共聚物包括甲氧基聚乙二醇-聚己内酯共聚物。
31.在另一优选例中，所述水相介质选自下组：生理盐水、灭菌水、缓冲盐水、葡萄糖溶液、环糊精溶液、或其组合。
32.在另一优选例中，所述佐剂中还含有等渗调节剂，所述等渗调节剂的含量为0.1-8％(w/w)。
33.在另一优选例中，所述佐剂中还含有防腐剂，所述防腐剂的含量不超过0.1％(w/w)。
34.在另一优选例中，所述佐剂具有以下的一种或多种特征：
35.(1)所述佐剂在注射部位与疫苗多肽共定位，诱导短暂的细胞因子和趋化因子反应，并增加先天免疫细胞从血流中向注射部位的募集；
36.(2)所述佐剂增强先天免疫细胞在局部引流淋巴结处的募集。
37.在另一优选例中，所述药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂为磷酸盐或柠檬酸盐等生理上可接受的缓冲剂。
38.在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有式i结构或包含式i结构的寡聚体：
39.z-(j-u)n
ꢀꢀꢀ(i)40.式中，
41.z为抗原多肽，所述抗原多肽具有新型冠状病毒s蛋白的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自s蛋白的rbm区域的氨基酸序列；
42.u各自独立地为tlr7激动剂；
43.n为0或正整数；
44.j为化学键或连接子。
45.在另一优选例中，所述疫苗多肽选自下组：ly54-101、p67-101、或其组合。
46.在另一优选例中，所述纳米乳疫苗制剂被制备为注射剂。
47.在另一优选例中，所述纳米乳疫苗制剂的ph为6.0-8.0。
48.在另一优选例中，所述纳米乳疫苗制剂中的液滴粒径小于220nm，较佳地，80-180nm，更佳地，100-150nm。
49.在另一优选例中，所述纳米乳疫苗制剂中疫苗多肽的含量为0.1-4mg/ml。
50.在另一优选例中，所述纳米乳疫苗制剂具有选自下组的一个或多个特征：
51.(1)稳定性好，在4℃与40℃下放置1-2个月，粒径变化不超过1％。
52.(2)粒径均小于0.22μm，满足过滤除菌要求。
53.本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的疫苗制剂的方法，所述方法包括以下步骤：
54.(s1)提供一疫苗多肽；
55.(s2)将所述疫苗多肽与佐剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合，从而制得本发明所述的疫苗制剂。
56.具体地，所述方法包括以下步骤：
57.(i)提供一疫苗多肽；
58.(ii)将疫苗多肽与佐剂水相和/或佐剂油相充分混合；
59.(iii)将佐剂油相与佐剂水相混合，通过剪切搅拌或高压均质形成水包油的乳剂，从而获得所述疫苗制剂。
60.在另一优选例中，将疫苗多肽与佐剂油相混合。
61.在另一优选例中，所述佐剂油相通过以下方法制备：在惰性气体保护下，将角鲨烯1-15％(w/w)、α-生育酚0-15％(w/w)、乳化剂0.1-10.0％(w/w)，搅拌混合，直至形成均一的油相，从而获得佐剂油相，所述百分比按所述制剂的总重量计；优选地，所述惰性气体为氮气。
62.在另一优选例中，所述佐剂水相通过以下方法制备：在水相介质中，加入嵌段共聚物0.01-5％，搅拌溶解直至形成均一的水相，从而获得佐剂水相。
63.在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)，将步骤(iii)所得的疫苗制剂进行过滤、灭菌和包装。
64.本发明的第三方面，提供了一种所述的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂的用途，用于制备预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关疾病的药物。
65.在另一优选例中，所述冠状病毒sars-cov-2包括野毒株和/或突变株。
66.在另一优选例中，所述的突变株选自下组：b.1.1.7、b.1.617、b.1.351和p.1。
67.在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病选自下组：呼吸道感染、肺炎及其并发症、或其组合。
68.在另一优选例中，所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病为新型冠状病毒肺炎(covid-19)。
69.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
70.图1显示了ly54-101的化学结构信息。
71.图2显示了p67-101的化学结构信息。
72.图3显示了ly54-101的f2纳米乳和as03纳米乳的热稳定性分析对比。
73.图4显示了游离偶联肽和偶联肽纳米乳制剂在肌肉注射8h后，离体组织心、肝、脾、肺、肾的荧光定量结果
74.图5显示了游离偶联肽和偶联肽纳米乳制剂在肌肉注射8h后，腹股沟淋巴结的的
荧光成像定量结果。
75.图6显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴35后的血清rbd结合抗体水平。
76.图7显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴70后的血清rbd结合抗体水平。
77.图8显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴35后的血清中和抗体水平。
78.图9显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴70后的血清中和抗体水平。
79.图10显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清阻断新冠病毒野毒株假病毒入侵宿主细胞。
80.图11显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清阻断新冠病毒英国株假病毒入侵宿主细胞。
81.图12显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清耐受多种rbd上氨基酸的突变。
82.图13显示了偶联肽纳米乳制剂免疫食蟹猴后的抗血清阻断新冠病毒真病毒入侵宿主细胞。
83.图14显示了攻毒过程中鼻拭子和咽拭子的病毒载量监测。
84.图15显示了攻毒后食蟹猴肺组织病毒载量。
具体实施方式
85.本发明人经过广泛而深入的研究和大量的筛选，首次研发出一种适合tlr7激动剂偶联肽的疫苗制剂配方，并使用所述配方制备得到了一种新型的基于tlr7激动剂偶联肽的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗。在本发明中，通过将tlr7激动剂偶联肽与不同配方的佐剂混合制备成偶联肽-佐剂组合物，并检测制备的各组合物的理化性质，确定了优选的疫苗制剂配方。体内外实验证明，使用本发明的优选配方制备得到的纳米乳疫苗在进入机体内后，可以诱导更高水平的体液免疫反应，刺激机体产生更高滴度的中和抗体，有效阻断病毒入侵宿主细胞，对机体的上下呼吸道均具有接近完全的保护作用。
86.实验证明，使用本发明的纳米乳疫苗免疫机体得到的抗血清不仅对冠状病毒sars-cov-2的野毒株具有高水平的中和活性，同时对突变株(如b.1.1.7)也具有相当的中和效果。因此，本发明的纳米乳疫苗不仅可以用于预防冠状病毒sars-cov-2野毒株的感染，对突变株感染也具有良好的预防作用。
87.在此基础上，完成了本发明。
88.疫苗多肽
89.本发明提供了一种含有冠状病毒sars-cov-2疫苗多肽的疫苗制剂，所述疫苗多肽包括抗原多肽以及任选地与所述抗原多肽偶联的tlr7激动剂。
90.在另一优选例中，所述的疫苗多肽具有式i结构或包含式i结构的寡聚体：
91.z-(j-u)n
ꢀꢀꢀ(i)92.式中，
93.z为抗原多肽，所述抗原多肽具有冠状病毒sars-cov-2s蛋白的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自s蛋白的rbm区域的氨基酸序列；
94.u各自独立地为tlr7激动剂；
95.n为0或正整数；
96.j为化学键或连接子。
97.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物和啮齿动物产生阻断rbd与ace2结合的中和抗体。
98.在另一优选例中，所述的疫苗多肽可激发灵长动物产生细胞免疫和体液免疫。
99.在另一优选例中，所述的灵长动物包括人、非人灵长类动物。
100.在另一优选例中，所述抗原多肽的长度为8-100个氨基酸，较佳地10-80个氨基酸。
101.在另一优选例中，所述的抗原多肽具有衍生自冠状病毒sars-cov-2s蛋白的rbd区域的氨基酸序列。
102.在另一优选例中，所述的抗原多肽具有衍生自rbd区域的rbm区域的氨基酸序列。
103.在另一优选例中，所述的rbm区域指冠状病毒sars-cov-2rbd蛋白的第438-506位氨基酸。
104.在另一优选例中，所述的抗原多肽“具有衍生自rbd蛋白的rbm区域的氨基酸序列”指所述抗原多肽的氨基酸序列与rbm区域的具有同源性(或同一性)，且所述同源性≥80％，较佳地≥85％，更佳地≥90％，最佳地≥95％。
105.在另一优选例中，所述的抗原多肽为人工合成的或重组的抗原多肽。
106.在另一优选例中，所述的抗原多肽的结构如式ii所示：
107.x1-x-x2
ꢀꢀꢀ
(ⅱ)，
108.式中，
109.(a)x为核心片段,其中，所述的核心片段的序列选自seq id no:1-12(见表a)中的一个或多个；
110.(b)x1、x2各自独立地为无、1、2或3个氨基酸，且x1和x2的氨基酸个数总和≤4，较佳地，3、2、1，更佳地为0或1；在另一优选例中，x1、x2各自独立地为无、k、c、g、l、a。
111.(c)
“‑”
表示肽键、肽接头、或其他连接子(即x1与x之间和/或x与x2之间，以肽键、肽接头(如1-15个氨基酸构成的柔性接头)或其他连接子相连)。
112.表a抗原多肽
113.[0114][0115]
在另一优选例中，tlr激动剂的分子数n为1、2、3、4、5或6；较佳地为1，2，3或4。
[0116]
在另一优选例中，所述的tlr7激动剂为小分子激动剂。
[0117]
在另一优选例中，所述的tlr7激动剂包括：szu-101:
[0118][0119]
在另一优选例中，tlr7激动剂(如szu-101)连接于抗原多肽的末端氨基或侧链氨基。
[0120]
在另一优选例中，tlr7激动剂(如szu-101)连接于抗原多肽的巯基。
[0121]
在另一优选例中，所述的szu-101连接于抗原多肽的氨基，并形成s1所示结构：
[0122][0123]
或者
[0124]
所述的szu-101连接于抗原多肽的巯基，并形成s2所示结构：
[0125][0126]
在另一优选例中，所述疫苗多肽选自下组的偶联肽：
[0127]
(s1)-lfrk(-s1)snlk(-s1)pferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpy(ly54-101,seq id no:1)其中，szu-101与氨基酸序列中l的n端氨基和k的侧链氨基通过s1结构连接；
[0128]
gyawnrkrisnc(-s2)vadysvlynsasfstfk(p67-101，seq id no:2)
[0129]
其中，szu-101与多肽中c上的巯基通过s2结构相连；
[0130]
并且s1和s2结构如上定义。
[0131]
角鲨烯
[0132]
本发明所述的角鲨烯是一种人体经胆固醇合成途径合成的可完全代谢的脂类。角
鲨烯主要来源于鲨鱼肝脏，特别是同齿刺鲨鱼、喙吻田氏鲨、南方乌鲨等角鲨烯含量较高的鲨鱼，也可从橄榄油、棕榈油、麦胚油和酵母中提取。以角鲨烯为主要油相的纳米乳佐剂可增强体液免疫应答和细胞免疫应答，刺激浆细胞的成熟，让机体产生足够的抗体，对抗病毒。在人体i期到iii期临床试验中证明没有明显的毒副作用，安全可靠。
[0133]
α-生育酚
[0134]
本发明所述的α-生育酚作为一种免疫刺激剂在乳剂中发挥作用。α-生育酚是维生素e的8种同工型之一，自然界分布最广。添加α-生育酚的乳剂能够增加单核细胞对抗原的摄取，增强细胞因子的产生，产生更高的抗体应答。本发明中使用的α-生育酚主要通过合成途径获得。
[0135]
乳化剂
[0136]
本发明所述所述乳化剂可选自聚山梨酯80及其它聚山梨酯类、磷脂、蔗糖酯、柠檬酸脂肪酸甘油酯类、脂肪酸甘油脂类、脂肪酸山梨坦类、环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚乙二醇、甲壳质、甲壳胺、胆酸及其盐类等的一种或多种。
[0137]
嵌段共聚物
[0138]
本发明所述的嵌段共聚物是一种可生物降解的聚合物，在水中可以自发的形成亲水基团朝外、疏水基团朝内的具有核-壳结构的球形纳米粒子，能够提高药物包封率和生物相容性，并促使淋巴结引流。在另一优选例中，所述嵌段共聚物为医用嵌段共聚物。在另一优选例中，所述嵌段共聚物的数均分子量或重均分子量为300-200000，较佳地500-100000。
[0139]
本发明所述的嵌段共聚物包括甲氧基聚乙二醇-聚己内酯(mpeg-pcl，peg:350、550、750、1000、3400、5000、10000、20000；pla：2000、5000)，甲氧基聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸(mpeg-plga，peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000；plga：1000、2000、5000、10000、15000、20000、40000)，聚乳酸羟基乙酸-聚乙烯亚胺(plga-pei，plga：1000、2000、5000、10000、15000、20000、40000；pei:600、1800、10000、70000)，聚乳酸-聚乙二醇(pla-peg，pla：2000、5000；peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000)，聚磷酸酯两嵌段共聚物(pcl-b-phep，peg:1000、2000、3400、5000、10000、20000)，聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(泊洛沙姆188等)，聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(peo-ppo-peo)中的一种或多种。
[0140]
本发明的纳米乳疫苗
[0141]
本发明提供了一种冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂，所述疫苗制剂包含：
[0142]
(a)冠状病毒sars-cov-2疫苗多肽，所述疫苗多肽包括抗原多肽以及任选地与所述抗原多肽偶联的tlr7激动剂；
[0143]
(b)佐剂，所述佐剂是基于角鲨烯的水包油型纳米乳剂；和
[0144]
(c)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0145]
具体地，所述佐剂包含以下组分：角鲨烯1-15％(w/w)，α-生育酚0-15％(w/w)，乳化剂0.1-10.0％(w/w)，和嵌段共聚物0.005-10％(w/w)，按所述制剂的总重量计。所述佐剂还包含水相介质。
[0146]
本发明疫苗制剂中所用佐剂包含油相部分和水相部分。其中，所述佐剂的油相部分包含：角鲨烯1-15％(w/w)，α-生育酚0-15％(w/w)，和乳化剂0.1-10.0％(w/w)；所述佐剂的水相部分包含：嵌段共聚物0.005-10％(w/w)和水相介质，按所述制剂的总重量计。
[0147]
本发明的新型冠状病毒偶联肽疫苗，以纳米乳为佐剂，该佐剂在注射部位与抗原共定位，诱导短暂的细胞因子和趋化因子反应，并增加先天免疫细胞从血流中向注射部位的募集。主要是单核细胞被激活成为抗原呈递细胞，载有抗原迁移至引流淋巴结。另外，该佐剂增强先天免疫细胞在局部引流淋巴结处的募集。抗原呈递细胞激活幼稚的cd4+t细胞，激活的cd4+t细胞与抗原特异性b细胞相互作用，诱导大量记忆b细胞和分泌抗体的浆细胞。
[0148]
制备方法
[0149]
本发明还提供了一种制备本发明第一方面所述的疫苗制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0150]
(s1)提供一疫苗多肽；
[0151]
(s2)将所述疫苗多肽与佐剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合，从而制得本发明第一方面所述的疫苗制剂。
[0152]
具体地，所述方法包括以下步骤：
[0153]
(i)提供一疫苗多肽；
[0154]
(ii)将疫苗多肽与佐剂水相和/或佐剂油相充分混合；
[0155]
(i ii)将佐剂油相与佐剂水相混合，通过剪切搅拌或高压均质形成水包油的乳剂，从而获得所述疫苗制剂。
[0156]
在另一优选例中，将疫苗多肽与佐剂油相混合。
[0157]
在另一优选例中，所述佐剂油相通过以下方法制备：在惰性气体保护下，将角鲨烯1-15％(w/w)、α-生育酚0-15％(w/w)、乳化剂0.1-10.0％(w/w)，搅拌混合，直至形成均一的油相，从而获得佐剂油相，所述百分比按所述制剂的总重量计；优选地，所述惰性气体为氮气。
[0158]
在另一优选例中，所述佐剂水相通过以下方法制备：在水相介质中，加入0.01-5％嵌段共聚物，搅拌溶解直至形成均一的水相，从而获得佐剂水相。
[0159]
在另一优选例中，所述方法还包括步骤(iv)，将步骤(iii)所得的疫苗制剂进行过滤、灭菌和包装。
[0160]
应用
[0161]
本发明的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂可用于制备预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关疾病的药物。
[0162]
所述冠状病毒sars-cov-2感染包括野毒株和/或突变株引发的感染。所述的冠状病毒sars-cov-2相关疾病包括但不限于呼吸道感染、肺炎及其并发症等，例如新型冠状病毒肺炎(covid-19)。
[0163]
通常，可将本发明的疫苗制剂制成可注射剂施用，例如液体溶液或悬液。
[0164]
本发明的疫苗制剂可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。
[0165]
配制好的疫苗制剂可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、腹膜内、皮下、皮内、口服、或局部给药。
[0166]
使用(疫苗)组合物时，是将安全有效量的本发明所述疫苗多肽或肽集合施用于人，其中该安全有效量通常至少约1微克肽/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克肽/千克体重，较佳地该剂量是约1微克-1毫克肽/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药
途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0167]
本发明提供的新冠疫苗纳米乳疫苗注射剂的有益效果包括：
[0168]
(1)本发明提供的新型冠状病毒偶联肽疫苗，以纳米乳为佐剂，可通过增强免疫细胞在局部引流淋巴结处的募集作用，提高多肽抗原产生的免疫应答和抗体。
[0169]
(2)本发明的纳米乳佐剂所使用的原料安全性高，在发挥辅助免疫作用的同时不会造成安全隐患。
[0170]
(3)本发明的纳米乳佐剂及对应的纳米乳疫苗制剂的稳定性好，可极大地简便疫苗制剂的保存和运输条件。
[0171]
(4)所提供的疫苗配方与偶联肽具有良好的相容性，在制造方面也具有很好的兼容性，能够适用于一种或多种不同偶联肽的组合。
[0172]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0173]
实施例1：制备以tlr7激动剂偶联肽ly54-101为抗原的纳米乳剂疫苗
[0174]
如下表1所示，制备以tlr7激动剂偶联肽ly54-101(2mg/ml)为抗原的纳米乳剂疫苗。ly54-101的结构如图1所示。制备方法如下：
[0175]
(1)制备油相：将角鲨烯、α-生育酚、乳化剂在氮气保护下混合均匀，直至形成均一的油相，备用；
[0176]
(2)制备水相：在水相中，加入嵌段共聚物0.01-5％(w/w)或不加入，形成均一的水相，备用；
[0177]
(3)在氮气保护下将多肽ly54-101与油相充分混合；
[0178]
(4)混合含药油相与水相，通过剪切搅拌或高压均质形成水包油的乳剂；
[0179]
(5)将纳米乳经过0.22μm的滤膜过滤后，灌装，充氮，密封。
[0180]
表1 ly54-101 2mg/ml的不同处方
[0181][0182]
按照表1中的粒径大小可知，在固定量多肽ly54-101中，加入2.0-5.0％的角鲨烯，0.0-4.0％α-生育酚，0.05％蛋黄卵磷脂e80，制备的纳米乳的液滴粒径小于220nm。加入0.01-1.0％共嵌段聚合物对粒径无影响，符合过滤除菌要求，为优选处方。
[0183]
实施例2：制备以不同剂量及种类偶联肽为抗原的纳米乳剂疫苗
[0184]
如下表2所示，以不同剂量及种类偶联肽为抗原的纳米乳剂疫苗的制备方法如下：
[0185]
(1)制备油相：将角鲨烯2.5％(w/w)、α-生育酚2.5％(w/w)、聚山梨酯801.8％(w/w)在氮气保护下混合均匀，直至形成均一的油溶液，备用；
[0186]
(2)制备水相：在水相中，加入甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物0.5％(w/w)，形成均一的水溶液，备用；
[0187]
(3)在氮气保护下将脂溶性多肽加入油相，水溶性多肽加入水相，充分混合使其溶解；
[0188]
(4)混合溶有多肽的油相与水相，通过剪切搅拌或高压均质形成水包油的乳剂；
[0189]
(5)将纳米乳经过0.22μm的滤膜过滤后，灌装，充氮，密封。
[0190]
表2以不同剂量及种类偶联肽为抗原的纳米乳剂疫苗的不同处方
[0191][0192]
按照表2中的粒径大小可知，优选处方能够适应不同种类及不同剂量的偶联肽，制备纳米乳液滴粒径小于220nm，符合过滤除菌要求。其中偶联肽p67-101的结构如图2所示。
[0193]
实施例3：纳米乳剂疫苗的稳定性测定
[0194]
1、制备实验制剂组：
[0195][0196]
单种偶联肽制剂组：含ly54-101 2mg/ml的as03纳米乳剂和f2纳米疫苗乳剂；
[0197]
多种偶联肽制剂组：含ly54-101 2mg/ml+p67-101 1mg/ml的f2纳米疫苗乳剂；。
[0198]
2、多肽含量的测定：
[0199]
将制剂分别储存在4℃及40℃稳定性箱中，在第0、7、14、30、60天取样，采用
malvern nano-zs90动态光散射粒径电位测定仪测定其粒径。
[0200]
表3单种偶联肽f2纳米乳疫苗制剂稳定性结果
[0201][0202]
表4多种偶联肽f2纳米乳疫苗制剂的稳定性结果
[0203][0204]
结果表明：本发明的纳米乳疫苗制剂在4℃与40℃下放置60天，无变分层现象，粒径大小基本不变，表明本发明的纳米乳疫苗制剂性质稳定。
[0205]
通过高效液相谱hplc鉴定纳米乳疫苗的有效成分，本发明所述的f2纳米乳疫苗和as03纳米乳疫苗均能够使包载的多肽成分在4℃保持稳定。另外，本发明所述的f2纳米乳疫苗即使在40℃下放置一个月，其有效成分ly54-101仍然保持稳定，未发生降解，而作为对照的采用as03的纳米乳疫苗中有效成分ly54-101已经发生降解(图3)。这表明，本发明的纳米乳更适合于tlr7激动剂偶联肽，可保护偶联肽在高温条件下仍保持性质稳定。
[0206]
实施例4：纳米乳剂疫苗的淋巴结引流效果
[0207]
1、实验制剂组：
[0208][0209]
制剂均使用连接cy5的ly54-101为抗原，制备方法同实施例1所述。titermax组采用油包水型佐剂。
[0210]
2、实验方法：
[0211]
采用异氟烷将大鼠麻醉，并对大鼠左腿脱毛后，置于活体成像仪中进行给药前(0h)成像。于左大腿内侧肌内注射pbs、游离偶联肽、as03、f1和f2制剂100μl。注射8h后，将
101+p67-101(2:1,2mg+1mg,f2)组表现出了最高的rbd结合抗体滴度，最高达1：72900，说明本发明的偶联肽组合最佳为ly54-101和p67-101的2:1的组合。
[0227]
从食蟹猴免疫后的35天和70天的血清中的阻断rbd和ace2相互作用的中和抗体水平来看(图8和图9)，意外的是，从35天到70天，血清中的中和抗体水平在持续增加，中和抗体滴度最高可达1:5120。类似地，f2纳米乳的疫苗制剂诱导了显著高于as03纳米乳的中和抗体滴度，且ly54-101+p67-101(2:1,2mg+1mg,f2)组表现出了最高的中和抗体滴度。
[0228]
以上结果说明，本发明开发的纳米乳应用到偶联肽疫苗的制剂开发中表现出了优于as03纳米乳的免疫效果。而且，本发明的偶联肽纳米乳疫苗在食蟹猴体内诱导了高水平的体液免疫反应，食蟹猴免疫后血清中和抗体水平极高且持久，提示具有阻断病毒入侵作用。
[0229]
实施例6：纳米乳剂疫苗阻断病毒入侵
[0230]
为了进一步评价疫苗免疫食蟹猴后诱导的高水平体液免疫反应是否能够阻断病毒入侵宿主细胞，采用了假病毒和真病毒测试体系评估食蟹猴抗血清的假病毒阻断中和活性。
[0231]
在假病毒中和试验中，将100μl不同稀释度的血清样品与50μl含有sars-cov-2假病毒的上清液混合。该混合物在37℃下孵育1小时。然后将100μl的huh-7/ace2细胞加入到假病毒和血清样品的混合物中，在37℃下再孵育24小时。然后，取出上清液，将100μl荧光素酶检测液加入到每个孔中。孵育2分钟后，使用微孔板光度计测量荧光素酶活性。
[0232]
在真病毒测试体系中，sars-cov-2病毒野毒株在vero e6细胞中增殖。将血清样品在56℃下热灭活30分钟；然后将从1∶4开始的2倍连续稀释液与等体积的含有50％组织培养物的病毒溶液混合。将血清-病毒混合物在37℃、5％co2加湿的环境中孵育1小时。孵育后，将每个稀释度的100μl混合物一式两份加入到含有半融合的vero e6单层的细胞板上。该板在37℃下孵育4天。培养4天后，在显微镜下记录各孔的细胞病变效果(cpe)。取能保护50％以上细胞不受cpe影响的最高血清稀释度作为中和滴度。
[0233]
假病毒中和实验结果表明(图10和图11)，偶联肽纳米乳疫苗免疫后的食蟹猴血清具有高水平的中和活性，可以阻断假病毒入侵宿主细胞，滴度高达1:256(图10，野毒株)。
[0234]
同时，本发明的纳米乳疫苗可有效保护细胞免受突变株b.1.1.7感染，滴度高达1:512(图11，突变株b.1.1.7)。该结果表明，本发明的纳米乳疫苗对新型冠状病毒突变株的中和效果与野毒株相当，因此也可以用于预防新型冠状病毒突变株的感染。另外，本发明采用基于实施例5的rbd结合抗体检测方法，将野生型rbd替换为k417n、n439k、l452r、y453f、s477n、e484k、e484q和n501y的多种单氨基酸突变型rbd蛋白进行检测。结果表明，偶联肽纳米乳疫苗免疫食蟹猴后(第35天)，食蟹猴的抗血清与野生型rbd的结合能力对比与k417n、n439k、l452r、y453f、s477n、e484q和n501y的突变型rbd蛋白的结合能力均无差距(图12)，这提示rbd蛋白的多种突变不会针对本发明的多肽疫苗产生免疫逃逸，而且本发明疫苗不会被突变株b.1.1.7(包含n501y突变)和突变株b.1.617(包含l452r和e484q突变)产生免疫逃逸。食蟹猴的抗血清对于e484k突变的rbd的结合能力下降了三倍(图12)，但是仍保留了较高的抗体滴度，提示本发明疫苗仍能对突变株b.1.351(包含k417n、e484k和n501y)和p.1(包含e484k和n501y)提供良好免疫保护。
[0235]
真病毒中和实验结果表明(图13)，偶联肽纳米乳疫苗免疫后的食蟹猴血清具有高
水平的中和活性，可以阻断真病毒(野毒株)入侵宿主细胞，滴度高达1:39。
[0236]
以上结果表明，本发明的偶联肽纳米乳疫苗免疫食蟹猴后可以产生高水平的保护性中和抗体，可以预防新冠野毒株和突变株的感染。
[0237]
实施例7：攻毒试验评价疫苗制剂体内保护效果
[0238]
为评价本发明的偶联肽纳米乳疫苗的体内预防病毒感染的保护效果，在食蟹猴加强免疫14天后进行攻毒试验。
[0239]
本发明采用国内外最高病毒载量(1
×
107tcid
50
)攻毒(常用1
×
106tcid
50
)，随后的第1天，第3天，第5天和第7天通过鼻拭子和咽拭子监测上呼吸道病毒载量，在第七天对食蟹猴实施安乐死，取肺组织检测各肺叶病毒载量。病毒载量的检测通过qrt-pcr进行。
[0240]
在攻毒过程中，鼻拭子和咽拭子的病毒载量监测结果显示生理盐水组的食蟹猴的上呼吸道表现出高的病毒载量，而本发明的偶联肽纳米乳疫苗免疫的食蟹猴仅在攻毒后的第一天在鼻拭子中监测到低水平的病毒载量，之后不论在鼻还是咽中均未检出病毒rna(图14)。
[0241]
攻毒结束后，肺组织的病毒载量检测结果显示，本发明的偶联肽纳米乳疫苗免疫的食蟹猴的左右肺均为检出病毒rna，而生理盐水组的食蟹猴在左右肺的各个肺叶都有高水平的病毒载量(图15)。
[0242]
这些结果显示了本发明的偶联肽纳米乳疫苗具有极佳的保护效果，在极高的攻毒剂量下，仍可以预防食蟹猴感染sars-cov-2野毒株，对其上下呼吸道均具有接近完全的保护作用。
[0243]
讨论
[0244]
本发明在tlr7激动剂偶联肽的基础上，开发安全有效的人用新型佐剂，可以辅助偶联肽以在体内达到最佳的免疫效果。本发明开发的新型纳米乳表现出比临床使用的as03纳米乳更佳的性质，如制备得到的偶联肽纳米乳制剂的热稳定性更佳，可耐受40℃高温；再如本发明开发的新型纳米乳免疫效果更佳，可以诱发更高水平的针对rbd的中和抗体，并可对sars-cov-2野毒株和突变株提供高效保护，这可能与它良好的淋巴引流能力相关。
[0245]
本发明的tlr7激动剂偶联肽纳米乳新冠疫苗具有突出的预防sars-cov-2野毒株和突变株感染的作用，可预防sars-cov-2感染并对机体上下呼吸道均具有接近完全的保护作用，具备临床价值。
[0246]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：

1.一种冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包含：(a)冠状病毒sars-cov-2疫苗多肽，所述疫苗多肽包括抗原多肽以及任选地与所述抗原多肽偶联的tlr7激动剂；(b)佐剂，所述佐剂是基于角鲨烯的水包油型纳米乳剂；和(c)药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。2.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述佐剂包含以下组分：角鲨烯1-15％(w/w)，α-生育酚0-15％(w/w)，乳化剂0.1-10.0％(w/w)，和嵌段共聚物0.005-10％(w/w)，按所述制剂的总重量计。3.如权利要求1或2所述的制剂，其特征在于，所述角鲨烯来源于鲨鱼肝脏、橄榄油、棕榈油、麦胚油和/或酵母。4.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述乳化剂选自下组：磷脂、聚山梨酯类、蔗糖酯、柠檬酸脂肪酸甘油酯类、脂肪酸甘油脂类、脂肪酸山梨坦类、环糊精、聚氧乙烯脂肪酸酯类、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、聚乙二醇、泊洛沙姆、甲壳质、甲壳胺、胆酸及其盐类、或其组合。5.如权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述嵌段共聚物选自下组：甲氧基聚乙二醇-聚己内酯、甲氧基聚乙二醇聚乳酸-羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸-聚乙烯亚胺、聚乳酸-聚乙二醇、聚磷酸酯两嵌段共聚物、聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物、聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物、或其组合。6.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述的疫苗多肽具有式i结构或包含式i结构的寡聚体：z-(j-u)n(i)式中，z为抗原多肽，所述抗原多肽具有新型冠状病毒s蛋白的至少一个t细胞表位和/或至少一个b细胞表位；并且，所述的抗原多肽具有衍生自s蛋白的rbm区域的氨基酸序列；u各自独立地为tlr7激动剂；n为0或正整数；j为化学键或连接子。7.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述纳米乳疫苗制剂中疫苗多肽的含量为0.1-4mg/ml。8.如权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述纳米乳疫苗制剂具有选自下组的一个或多个特征：(1)稳定性好，在4℃与40℃下放置1-2个月，制剂中纳米乳粒径变化不超过1％；(2)纳米乳粒径均小于0.22μm，满足过滤除菌要求。9.一种制备权利要求1所述的疫苗制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(s1)提供一疫苗多肽；(s2)将所述疫苗多肽与佐剂和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合，从而制得权利要求1-8任一项所述的疫苗制剂。10.如权利要求1-8任一项所述的冠状病毒sars-cov-2纳米乳疫苗制剂的用途，其特征在于，用于制备预防冠状病毒sars-cov-2感染或其相关疾病的药物。

技术总结

本发明涉及一种以TLR7激动剂偶联肽为抗原，乳剂为佐剂的新型冠状病毒疫苗。其中，所述偶联肽的抗原多肽是衍生自冠状病毒SARS-CoV-2的S蛋白的多肽，所述佐剂为含有角鲨烯的水包油型纳米乳剂。本发明的偶联肽纳米乳疫苗制剂具有突出的热稳定性，在食蟹猴中可以引发高水平的保护性体液免疫反应，食蟹猴免疫后抗血清的中和抗体滴度高，可高效阻断野毒株和突变株新型冠状病毒入侵。在食蟹猴SARS-CoV-2攻毒试验中，本发明的疫苗对食蟹猴上下呼吸道均具有接近完全的保护作用。本发明的纳米乳疫苗制备快速简便，可在短期内实现大规模生产用于应对新型冠状病毒突发疫情。新型冠状病毒突发疫情。