(10)申请公布号 CN 102628072 A
(43)申请公布日 2012.08.08C N 102628072 A
*CN102628072A*
(21)申请号 201210074163.5
(22)申请日 2012.03.20
C12P 21/06(2006.01)
C07K 14/62(2006.01)
C07K 1/18(2006.01)
(71)申请人甘李药业有限公司
地址101102 北京市通州区中关村科技园区
通州园金桥科技产业基地景盛北三街
8号
(72)发明人王大梅 李学勇
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种胰岛素的制备方法，该方法
切过程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B 作用
完全，并且能彻底去除未与羧肽酶B 反应的胰岛
素前体，从而提高最终胰岛素产品的纯度和质量，
使最终胰岛素纯品的纯度能达到99.7%以上，并
且回收率高，可以进行工业化生产。
(51)Int.Cl.
权利要求书2页 说明书7页 附图7页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 7 页
1.一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：
（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；
（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；
（3）纯化步骤2的酶切产物；
（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；
（5）使用阳离子交换层析纯化步骤4的酶切产物；
其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其中胰岛素选自人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤3中的纯化步骤选自阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水层析、排阻层析、HPLC之一或其组合。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其中步骤3中的纯化步骤包含阳离子交换层析纯化，并且层析介质与步骤5中的阳离子交换层析介质相同。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其中步骤5中阳离子交换层析的介质选自CM Sepharose™或SP Sepharose™。
6. 根据权利要求1-5中任一所述的制备方法，其还进一步包括在步骤5后使用HPLC 进行精纯的步骤。
7. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：
（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；
（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；
（3）使用CM Sepharose™ 纯化步骤2的酶切产物；
（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；
（5）再次使用CM Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；
（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；
其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
8. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：
（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；
（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；
（3）使用CM Sepharose™和DEAE Sepharose™纯化步骤2的酶切产物；
（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；
（5）再次使用CM Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；
（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；
其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
9. 一种胰岛素的制备方法，包括以下步骤：
（1）获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；
（2）使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；
（3）使用Q Sepharose™和SP Sepharose™纯化步骤2的酶切产物；
（4）使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；
（5）再次使用SP Sepharose™层析纯化步骤4的酶切产物；
（6）使用HPLC精纯步骤5的酶切产物；
其中所述胰岛素为A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素或胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
10. 根据权利要求7-9中任一项所述的制备方法，其中胰岛素选自人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素或赖谷胰岛素。
一种胰岛素的制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种胰岛素的制备方法，具体地说，涉及一种包括两步层析纯化胰岛素步骤的制备方法。
背景技术
[0002] 糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。而在中国，随着人民生活方式的改变和老龄化进程的加速，糖尿病的患病率呈快速上升趋势，到2011年底，中国已经确诊的糖尿病患者人数超过了9240万人，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。
[0003] 胰岛素一直被当作是糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素，到90年代，随着胰岛素技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的新一代胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素等。
[0004] 目前生产重组胰岛素的方法一般是先通过基因工程合成胰岛素原(pro-insulin)或胰岛素前体(pre-proinsulin)，再通过酶切形成胰岛素。胰岛素原由A链、B链、C链
-B链-Arg-Arg-C链-Lys-Arg-A (又叫连接肽)组成，其由N端至C端的连接顺序NH
2
链-COOH(参见附图1)。为了促进胰岛素原的正确折叠，人们有时会在B链N端通过Arg或Lys连接融合蛋白或信号肽，形成胰岛素前体。此外，为了生产不同结构的胰岛素类似物，人们会在胰岛素的A链或B链上进行氨基酸突变或是侧链连接，形成胰岛素类似物原或胰岛素类似物前体，但是其C链、融合蛋白或信号肽与A链、B链的连接关系一般不会改变。[0005] 胰蛋白酶和羧肽酶B是重组胰岛素生产过程中不可或缺的双酶。胰蛋白酶可以从肽链中精氨酸Arg或赖氨酸Lys的羧端切断肽链(EC3.4.21.4)；羧肽酶B可以切除肽链羧端的碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸(EC3.4.17.2)。在形成正确折叠的胰岛素原或胰岛素前体、或是胰岛素类似物原或胰岛素类似物前体后，用胰蛋白酶和羧肽酶B 酶切，可将
C链和其他连接肽切除，形成正确折叠的胰岛素或胰岛素类似物(参见附图1)。[0006] 因此，目前通过基因工程生产重组胰岛素的步骤一般为：工程菌发酵表达胰岛素原或胰岛素前体、提取包涵体或可溶性表达产物、纯化、复性、酶切、纯化。在原核表达的现有技术中，通常是在通过复性步骤得到具有正确构象的胰岛素原或胰岛素前体后，同时加入胰蛋白酶和羧肽酶B，酶切得到胰岛素，然后再通过离子树脂、HPLC等方法进行纯化(参见EP0055945、CN90101415.X、CN86106574、CN200610117742.8等)。这种同时加入两种酶的缺点是1.由于羧肽酶B只能酶切肽链羧端的碱性氨基酸，因此要等胰蛋白酶酶切后，羧肽酶B才能发挥作用，这样会导致酶切作用不完全，效率低；2.两种酶的作用位点不一致，会导致副产物多，酶切过程不易控制。
[0007] 在中国专利CN98813941.3中，公开了另一种制备重组胰岛素的方法，该方法在获
得正确构象的胰岛素前体后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正确构象的Arg(B31)-胰岛素，纯化后再用羧肽酶B去除Arg(B31)-胰岛素C端的Arg，形成正确构象的胰岛素，最后再用HPLC纯化。该方法虽然分别采用胰蛋白酶和羧肽酶B进行两步酶切，但是在羧肽酶B酶切之后直接用HPLC进行纯化，会导致有些未与羧肽酶B反应的Arg(B31)-胰岛素与胰岛素难以分离，影响最终产品的纯度。该专利中最终人胰岛素的纯度为99％，由于胰岛素制剂是注射到人体内的药物制剂，因此目前国际上对胰岛素终产品纯度的要求非常严格，规定单个杂质的含量不能超过0.1％，杂质总量不能超过0.3％，即胰岛素纯度需要达到99.7％以上。而上述专利的制备方法均不能达到该要求，实际上，在现有技术中，如要高回收率的制备
纯度达到99.7％以上的胰岛素，并且实现工业化生产是非常困难的。
发明内容
[0008] 本发明的目的是解决上述现有问题，提供一种包括两步层析纯化胰岛素步骤的制备方法，该方法能提高酶切效率和酶切过程中的可控性，使胰蛋白酶和羧肽酶B作用完全，并且能彻底去除未与羧肽酶B反应的胰岛素前体，从而提高最终胰岛素产品的纯度和质量，使最终胰岛素纯品的纯度在99.7％以上，并且回收率很高，可以进行工业化生产。[0009] 因此，为了实现本发明的目的，本发明提供一种胰岛素的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0010] 1.获得正确构象的胰岛素原或胰岛素前体；
[0011] 2.使用胰蛋白酶酶切步骤1的胰岛素原或胰岛素前体；
[0012] 3.纯化步骤2的酶切产物；
[0013] 4.使用羧肽酶B酶切步骤3的纯化产物；
[0014] 5.使用阳离子交换层析纯化步骤4的酶切产物。
[0015] 所述胰岛素为任何A、B链羧端氨基酸选自非碱性氨基酸的人胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素衍生物，所述碱性氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等。优选的胰岛素包括但不限于人胰岛素、赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素等。
[0016] 步骤1中所述正确构象的胰岛素原或胰岛素前体可以通过各种本领域技术人员所公知的现有技术获得。例如，可参见EP0055945发明详述中步骤A1至C1获得正确构象的人胰岛素原，参见CN98813941.3实施例5-5.3获得正确构象的hGH-小胰岛素原，参见CN90101415.X的各实施例(如实施例29)或CN 98114950.2的各实施例(如实施例2)获得正确构象的胰岛素类似物原等。此外，还可以通过US5358857、Villa-Komaroff et al.，PNAS，1978，75(8)：3727-3731，Thim et al，PNAS，1986，83：6766-6770等文献中介绍的方法获得，或是采用其他公知肽合成技术制备，例如溶液法、固相合成法(J.Stewart等，
《固相肽合成》，Freeman and Co.，San Francisco，1969)、半合成法、基因工程法、DNA重组法等。[0017] 步骤2中的胰蛋白酶可以从肽链中精氨酸Arg或赖氨酸Lys的羧端切断肽链。用胰蛋白酶酶切步骤1中的胰岛素原或胰岛素前体，可以切除胰岛素A链、B链之间的连接肽以及与B链连接的融合蛋白或信号肽，从而得到正确构象的具有B31位精氨酸(Arg B31)的胰岛素前体(参见附图1)。所述使用胰蛋白酶进行酶切的方法可通过各种本领域技术人员所公知的方法进行，例如以上述参考文献中所公开的胰蛋白酶酶切条件进行。具体的说，可以先将步骤1中的胰岛素原或胰岛素前体配制成浓度为1-15mg/ml的溶
液，调pH值至碱性
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