(10)申请公布号 (43)申请公布日 2010.12.08*CN101910193A*
(21)申请号 200880124022.1
(22)申请日 2008.12.22
07124141.8 2007.12.28 EP
C07K 1/10(2006.01)C07K 14/605(2006.01)(71)申请人诺沃-诺迪斯克有限公司
地址丹麦鲍斯韦
(72)发明人J·F·刘 A·S·安德森
P·布洛克 J·刘 P·W·加里贝
T·克鲁斯 I·S·N·诺比
C·U·杰森 C·克里斯滕森
J·C·诺里尔德
(74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公
司 72001
代理人李进 李连涛
(54)发明名称
GLP-1类似物的半重组制备法
(57)摘要
本发明涉及结合使用重组表达技术和化学肽
合成法产生在N 端部分含非蛋白氨基酸的GLP-1
(85)PCT申请进入国家阶段日
2010.06.28
(86)PCT申请的申请数据
PCT/EP2008/068211 2008.12.22
(87)PCT申请的公布数据
WO2009/083549 EN 2009.07.09(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 6 页 说明书 60 页 序列表 15 页附图 14 页CN 101910193 A
C N 101910193 A
1.一种用于制备在N端部分包含一个或多个非蛋白氨基酸的GLP-1类似物或衍生物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)对包含编码所述GLP-1类似物的前体分子的核苷酸序列的宿主细胞在用于表达所述前体分子的适当条件下进行培养， ii)从液体培养基中分离出表达的前体分子，
iii)将包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端与表达的前体分子偶联，iv)通过合适的方法分离所得到的GLP-1类似物或衍生物。
2.权利要求1的方法，其中将所述前体分子的赖氨酸基团在步骤ii)后保护起来，并且在N端突出端偶联后再脱保护。
3.权利要求1的方法，其中将所述N端氨基酸突出端保护起来后用于步骤iii)，并且在N端突出端偶联后再脱保护。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16-Ser-Xaa
18
-Xaa
19
-Xaa
20
-Glu-Xaa
22
-Xaa
23
-Ala-Xaa
25
-
Xaa
26
-
Xaa
27-Phe-Ile-Xaa
30
-Trp-Leu-Xaa
33
-Xaa
34
-Xaa
35
-Xaa
36
-Xaa
37
-Xaa
38
-Xaa
39
-Xaa
40
-
Xaa
41
-Xaa
42
-Xaa
43-Xaa
44
-Xaa
45
其中
Xaa
16
为Val或Leu；
Xaa
18
为Ser、Lys或Arg；
Xaa
19
为Tyr或Gln；
Xaa
20
为Leu或Met；
Xaa
22
为Gly或Glu；
Xaa
23
为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa
25
为Ala或Val；
Xaa
26
为Lys、Glu或Arg；
Xaa
27
为Glu或Leu；
Xaa
30
为Ala、Glu或Arg；
Xaa
33
为Val、Lys或Arg；
Xaa
34
为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa
35
为Gly；
Xaa
36
为Arg、Gly或Lys；
Xaa
37
为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa
38
为Lys、Ser，或不存在；
Xaa
39
为Ser、Lys，或不存在；
Xaa
40
为Gly，或不存在；
Xaa
41
为Ala，或不存在；
Xaa
42
为Pro，或不存在；
Xaa
43
为Pro，或不存在；
Xaa
44
为Pro，或不存在；
Xaa
45
为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa
38、Xaa
39
、Xaa
40
、Xaa
41
、Xaa
42
、Xaa
43
、Xaa
44
或Xaa
45
不存在，则下游每个氨
基酸残基也不存在。
5.权利要求1-3中任-项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa
9-Xaa
10
-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16
-Ser-Xaa
18
-Xaa
19
-Xaa
20
-Glu-Xaa
22
-
Xaa
23
-Ala-
Xaa
25-Xaa
26
-Xaa
27
-Phe-Ile-Xaa
30
-Trp-Leu-Xaa
33
-Xaa
34
-Xaa
35
-Xaa
36
-Xaa
37
-Xaa
38
-
Xaa
39
-Xaa
40
-Xaa
41-Xaa
42
-Xaa
43
-Xaa
44
-
Xaa
45
其中
Xaa
9
为Glu或Asp；
Xaa
10
为Gly或Ala；
Xaa
16
为Val或Leu；
Xaa
18
为Ser、Lys或Arg；
Xaa
19
为Tyr或Gln；
Xaa
20
为Leu或Met；
Xaa
22
为Gly或Glu；
Xaa
23
为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa
25
为Ala或Val；
Xaa
26
为Lys、Glu或Arg；
Xaa
27
为Glu或Leu；
Xaa
30
为Ala、Glu或Arg；
Xaa
33
为Val、Lys或Arg；
Xaa
34
为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa
35
为Gly；
Xaa
36
为Arg、Gly或Lys；
Xaa
37
为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa
38
为Lys、Ser，或不存在；
Xaa
39
为Ser、Lys，或不存在；
Xaa
40
为Gly，或不存在；
Xaa
41
为Ala，或不存在；
Xaa
42
为Pro，或不存在；
Xaa
43
为Pro，或不存在；
Xaa
44
为Pro，或不存在；
Xaa
45
为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa
38、Xaa
39
、Xaa
40
、Xaa
41
、Xaa
42
、Xaa
43
、Xaa
44
或Xaa
45
不存在，则下游每个氨
基酸残基也不存在。
6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述GLP-1类似物的前体分子选自包含以下通式的氨基酸序列的前体分子：
Xaa
8-Xaa
9
-Xaa
10
-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa
16
-Ser-Xaa
18
-Xaa
19
-Xaa
20
-Glu-Xaa
22
-Xaa
23
-
Ala-Xaa
25-Xaa
26
-Xaa
27
-Phe-Ile-Xaa
30
-
Trp-Leu-Xaa
33
-Xaa
34
-Xaa
35
-Xaa
36
-Xaa
37
-Xaa
38
-Xaa
39
-
Xaa
40-Xaa
41
-Xaa
42
-Xaa
43
-
Xaa
44
-Xaa
45
其中
Xaa
8
为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys；
Xaa
9
为Glu、Asp；
Xaa
10
为Gly、Ala；
Xaa
16
为Val或Leu；
Xaa
18
为Ser、Lys或Arg；
Xaa
19
为Tyr或Gln；
Xaa
20
为Leu或Met；
Xaa
22
为Gly或Glu；
Xaa
23
为Gln、Glu、Lys或Arg；
Xaa
25
为Ala或Val；
Xaa
26
为Lys、Glu或Arg；
Xaa
27
为Glu或Leu；
Xaa
30
为Ala、Glu或Arg；
Xaa
33
为Val、Lys或Arg；
Xaa
34
为Lys、Glu、Asn、His或Arg；
Xaa
35
为Gly；
Xaa
36
为Arg、Gly或Lys；
Xaa
37
为Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；
Xaa
38
为Lys、Ser，或不存在；
Xaa
39
为Ser、Lys，或不存在；
Xaa
40
为Gly，或不存在；
Xaa
41
为Ala，或不存在；
Xaa
42
为Pro，或不存在；
Xaa
43
为Pro，或不存在；
Xaa
44
为Pro，或不存在；
Xaa
45
为Ser，或不存在；
条件是如果Xaa
38、Xaa
39
、Xaa
40
、Xaa
41
、Xaa
42
、Xaa
43
、Xaa
44
或Xaa
45
不存在，则下游每个氨
基酸残基也不存在。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端中的非蛋白氨基酸选自γ-羧基谷氨酸、鸟氨酸、磷酸丝氨酸、D-氨基酸例如D-丙氨酸和D-谷氨酰胺、D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib(α-氨基异丁酸)、Abu(α-氨基丁酸)、Tle(叔丁基甘氨酸)、3-氨基甲基苯甲酸、、脱-氨基-组氨酸、β-丙氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、4-吡啶基丙氨酸、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸、(1-氨基环辛基)甲酸、α-甲基脯氨酸、1-甲基组
氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa
7-Xaa
8
-Xaa
9
-Xaa
10
其中
Xaa
7
选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸；
Xaa
8
选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Lys、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸；
Xaa
9
选自Glu、Asp、γ，γ-二甲基Glu、β，β-二甲基Glu和β，β-二甲基Asp，和
Xaa
10
选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸和(1-氨基环辛基)甲酸。
9.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个或多个非蛋白氨基酸的N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa
7-Xaa
8
其中
Xaa
7
选自L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸；和
Xaa
8
选自Gly、Aib、(1-氨基环丙基)甲酸、(1-氨基环丁基)甲酸、(1-氨基环戊基)甲酸、(1-氨基环己基)甲酸、(1-氨基环庚基)甲酸或(1-氨基环辛基)甲酸和α-甲基脯氨酸。
10.权利要求1-7中任一项的方法，其中包含一个非蛋白氨基酸的所述N端氨基酸突出端具有以下通式
Xaa
7
其中
Xaa
7
选自D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、Nα-乙酰基-组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和4，5，6，7-四氢-1H-咪唑并[4，5-C]吡啶-6-甲酸β-(1，2，4-三唑-1-基)-丙氨酸。
11.权利要求10的方法，其中所述N端氨基酸突出端是脱氨基-组氨酸，并且偶联反应由4-[2-(2，5-二氧代-吡咯烷-1-基氧基羰基)-乙基]-1H-咪唑-1-鎓盐例如盐三氟乙酸盐与表达的前体分子进行。
12.权利要求1-11中任一项的方法，所述方法还包括用酯化剂使表达的前体分子中的
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