[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101619308A [43]公开日2010年1月6日
[21]申请号200910063625.1[22]申请日2009.08.14
[21]申请号200910063625.1
[71]申请人湖北神地农业科贸有限公司
地址430064湖北省武汉市洪山区珞狮路517号
明泽大厦5048
[72]发明人郭顺堂 杨砚 郑海涛 黄兵林 姜馗 李
尧 熊志祥 曾龙虎 刘明忠 杨丰帆 [74]专利代理机构武汉宇晨专利事务所代理人王敏锋
[51]Int.CI.C12N 9/36 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制
备方法，步骤：A.在室温下，往蛋清中加入软化水，
稀释；B.进行均质；C.均质后的溶液，调pH值；D. 化钠溶液在搅拌罐里搅拌，用软化水洗；E.将活化
好的离子交换树脂与蛋清混合搅拌；F.将搅拌罐的
上清液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的杂蛋白；
G.将氯化钠溶液与清洗干净的树脂搅拌，洗脱吸附
到离子交换树脂中的溶菌酶；H、将搅拌罐中上清
液倾出，滤干，用软化水清洗树脂中的残留溶菌酶；
J.超滤，浓缩，除盐；K.将浓缩得到的溶菌酶通过
干燥得到溶菌酶粉。本发明简单易行，价格低廉，
鸡蛋清没有发生变化，保持了品质，大规模工业化
生产。
200910063625.1权 利 要 求 书第1/1页
1、一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法，其步骤是：
A、在室温下18-25℃，往蛋清中加入软化水，将蛋清稀释0.5-1.5倍；
B、用均质机于常温18-25℃，压力8-11M P a条件下，进行均质；
C、均质后的蛋清溶液，用2m o l/L的氯化氢溶液调p H值到4-6.8；
D、离子交换树脂再生：用质量浓度为4-6％的氢氧化钠溶液，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与氢氧化钠溶液的以体积比1∶2混合，在搅拌罐里搅拌2-2.5小时后，用软化水洗至流出液pH值＝9.5-12.5，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂才活化好；
E、将活化好的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂与蛋清以体积比例1∶6混合，在搅拌罐内搅拌吸附30-90分钟；
F、将搅拌罐的上清液倾出，滤干，用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的杂蛋白，直到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中溶液的TDS为300-500mg/L，D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂方洗干净，去掉溶菌酶的蛋清；
G、将0.4mol/L的氯化钠溶液与清洗干净的D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂以以比体积比5∶1混合，在搅拌罐中搅拌，洗脱吸附到D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的溶菌酶，洗脱时间为120-150分钟；
H、将搅拌罐中上清液倾出，滤干，用软化水清洗D152大孔丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂中的残留溶菌酶2-3次；
J、超滤机在温度23-28℃，进膜压力6-8bar时超滤，浓缩，除盐，其间不断加水，直到流出液的盐度达到0.1％质量比；
K、将浓缩得到的溶菌酶通过喷雾干燥得到溶菌酶粉，干燥塔进口温度：120-160℃；出口温度：50-75℃。
200910063625.1说 明 书第1/12页
从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法
技术领域
本发明涉及生物、医药及食品工业技术领域，更具体涉及一种从鸡蛋清中提取溶菌酶的制备方法。
背景技术
1.溶菌酶的用途广泛
溶菌酶的用途很广，生物技术中，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取；在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，广泛应用于临床医学，溶菌酶作为存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效；在食品工业中由于溶菌酶本身是天然蛋白质，无毒性，是安全性高的食品添加剂，可以作为防腐、保鲜剂，广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜。
如今，全国各地鸡蛋生产发展迅猛，鸡蛋的销量不断增加，蛋品的深加工成为大家日益关注的问题。因此，蛋清中溶菌酶提取的研究成为当今一大热门课题。
2.溶菌酶的特殊生物学活性
溶菌酶纯品为白粉状晶体，无臭、微甜，易溶于水和盐溶液，不溶于丙酮、乙醚，遇碱易被破坏。溶菌酶对革兰氏阳性菌(如溶壁小球菌、黄八叠球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌)有溶菌作用，一般对革兰氏阴性菌无效。实验证明，溶菌酶可催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解细菌的细胞壁。底物与酶结合后，溶菌酶专一性地作用于N A M-N A G键。细胞壁肽聚糖支架被破坏，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。因此，溶菌酶能选择性地分
解微生物的细胞壁，同时不破坏其他组织，对人体细胞不会产生降解作用，不但安全性很高，而且具有一定的保健作用。
3溶菌酶及其研究进展
溶菌酶(l y s o z y m e)是由弗莱明在(1922)年发现的有效的抗菌剂，全称为1-4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，分子量为14000-15000，等电点11左右。蛋清中溶菌酶是由129个氨基酸组成的碱性球蛋白，它能切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1-4，糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。
目前，国外已经生产出活性达50000U/m g的溶菌酶，而国内生产溶菌酶的酶活性较低，大多只有18000U/m g左右，纯度也不高。本课题研究了提取高活性溶菌酶的方法及大规模生产的工艺参数，可以工业化生产出活性大于等于40000U/mg的溶菌酶。
溶菌酶的提取主要有以下的几种方法：
直接结晶法：溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，而蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件，利用这一特点，在蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸盐等盐类，并调p H值至9.5-10.0，降低温度，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然存留在溶液中。在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品，采用结晶纯化步骤，酶液经超滤处理后，用氢氧化钠调整p H 9.5，离心去除杂质，上清液在缓缓搅拌下，加氯化钠至5％，静置一周，得粗结晶。粗结晶溶于p H 4.6的醋酸水中，分去不溶物后，进行重结晶，二次结晶的最终得率为60％左右。活力测定为8000U/mg。
直接结晶法生产周期长，收率低，纯度和活性低，不适合工业化生产。 聚丙烯酸沉淀法：聚丙烯酸沉淀法首先经过吸附步骤，即将鸡蛋清用20％的氯化氢溶液调p H至6.0，在调p H值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白沉淀析出，然后加入15％聚丙烯酸，立即有白沉淀析出，加至p H值为3.0为止，静置17个小时进行倾析，得到粘附于底部的乳白胶状物。第二步解离，将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5m o l/L的碳酸钠溶液，
将其溶解，转移后，将p H值调到9.5。加入5％氯化钙溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐析，将所得澄清溶液加入5％的N a C l溶液搅拌均匀.放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。
聚丙烯酸沉淀法生产周期较长，提取过程中使用的试剂存在不安全因素，产品不适用于食品医药等行业。
超滤法：超滤是一种以压力为动力，利用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程。蛋清溶菌酶是小分子物质，并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力，以结合态存在，采用不同的前处理工艺，降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力，使溶菌酶处于解离状态后，采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取。张灏等人通过试验初步确立了蛋清溶菌酶的超滤工艺：即料液的p H值8.5，采用截留相对分子质量为3万的P E S膜，连续方式稀释3倍进行超滤；透过液用截留相对分子质量
为3000的P E S膜进行浓缩，冷冻干燥后得到蛋清溶菌酶样品，酶活力为每毫克蛋白质14610U或16831U，经电泳检测酶的纯度较高。
超滤法操作简单，提取过程无有害物质引入，适合工业化生产，但提取方法比较粗放，产品质量较差。
离子交换树脂法：离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋-预处理-搅拌吸附-上柱洗脱-等电点沉淀-透析-喷雾干燥-成品。蛋清将调至p H-4.6(卵粘蛋白等电点，于沸水浴迅速升温至75℃，维持5m i n，流水冷却至室温，用质量浓度为20％的氢氧化钠调p H至9.5，静置5-6h，过滤或离心除去沉淀，再将p H调至中性。724树脂经浸泡处理去杂质，以2m o l/L氢氧化钠转型为N a+型阳离子树脂，1/15(m o l/L)磷酸缓冲液(p H6.46)平衡过夜。动态交换法洗脱，先将处理转型后的树脂装柱，鸡蛋清以1.6m L/m i n流速缓慢通过处理好的724树脂柱，再用3倍体积1/15(m o l/L)磷酸缓冲液(p H6.46)洗涤树脂柱，除去未吸附杂质，以质量浓度为10％的硫酸铵溶液洗脱，洗脱液经核酸蛋白检测仪(λ＝280n m)检测，部分收集器收集含溶菌酶的洗脱液。树脂则
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