[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101665813A [43]公开日2010年3月10日
[21]申请号200910144926.7[22]申请日2009.09.14
[21]申请号200910144926.7
[71]申请人安徽华恒生物工程有限公司
地址231131安徽省合肥市双凤工业区经2路
[72]发明人张晓斌 刘迎伟 [74]专利代理机构合肥天明专利事务所代理人奚华保
[51]Int.CI.C12P 13/06 (2006.01)C12R 1/19 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 7 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明公开了一种L－丙氨酸的微生物发酵生
L －丙氨酸。种子培养基：葡萄糖12～20％，蛋白
胨0.4～0.6％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾
0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.
0；培养温度30±1℃；发酵培养基：葡萄糖10～20％，
玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾
0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用
氨水调pH值至6.0～8.0；发酵培养条件：培养温度
30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06MPa。本发明工艺
过程简单，控制条件粗放。发酵水平达到90－92g/
l ，大大降低了生产成本。
200910144926.7权 利 要 求 书第1/1页 1、一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法，包括利用大肠杆菌直接发酵葡萄糖培养基，其特征在于：
a、种子培养基和培养条件(质量百分比)：葡萄糖12～20％，蛋白胨0.4～
0.6％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；培养温度30±1℃；
b、发酵培养基：葡萄糖10～20％，玉米浆3～4％，硫酸镁0.02～0.03％，磷酸氢二钾(K2HPO4)0.01～0.02％，氯化钠0.2～0.3％，余量为水，用氨水调pH值至6.0～8.0；
发酵培养条件：培养温度30±2℃，通风比1∶3，罐压0.06M P a。
200910144926.7说 明 书第1/7页
一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法
技术领域
本发明涉及L-丙氨酸的生产方法，具体涉及一种L-丙氨酸的微生物发酵生产方法。
背景技术
L-丙氨酸在医药、食品、化工等行业有着十分广泛的用途。L-丙氨酸在医药上用途是V B6的重要原料，是营养增补剂(补糖氨基酸营养输液)的组成部分。由L-丙氨酸组成的复合氨基酸注射液-14氨基酸注射液-800是主治肝脑病新药，可肝功能不全时氨基酸代谢紊乱，促使肝昏迷病人苏醒，同时L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。例如生产L-氨基丙醇、V B6、S-2-、安尿通等。 L-丙氨酸一般是利用假单胞菌作为生物催化剂采用固定化或细胞悬液酶解L-天门冬氨酸生产，收率大于90％。
国内现有宁波科瑞生物工程公司、北京怡康盛达生物技术有限公司、安徽省科苑(集团)股份有限公司等多家公司均生产L-丙氨酸产品，产品有食品级和工业级，生产的方法大都是利用假单胞菌产生的L-天冬
氨酸-β-脱羧酶，将L-天冬氨酸转化成L-丙氨酸。南京工业大学(南京化工大学)开展L-丙氨酸酶法合成的研究较早，利用假单胞菌获得高活性的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，以L-天冬氨酸为底物，采用游离细胞法转化生产L-丙氨酸，平均收率为90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准；并拥有酶法生产L-丙氨酸的发明专利，该技术可生产得到光学纯度的L-丙氨酸；同时成立了国家生化工程技术中心，中心拥有年产1000吨L-丙氨酸的生产技术。大连轻工业学院对中空纤维膜反应器，利用假单胞菌转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。中国药科大学也对L-丙氨酸酶法生产技术进行了研究，采用循环式生物反应器，利用固定化德阿昆合假单胞菌体的L-天冬氨酸-β-脱羧酶，转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。
丙氨酸是细胞蛋白质必不可少的组成成分，多数微生物使用葡萄糖丙酮酸转移酶来合成丙氨酸(Hashimoto and Katsumata，1998)，一些生物体如节杆菌(Hashimoto and Katsumata，1993，1998；1999)、球形芽孢杆菌(Ohashima and Soda，1979)、梭状芽孢杆菌(Orlygssony等，1995)使用NADH-脱氢酶从丙酮酸和氨基酸来生产丙氨酸。
质粒转移基因编码NADH-脱氢酶作为实验手段用于促进合成得到不同程度的成功。基因工程菌株发酵单胞菌mobolis CP4在5％葡萄糖厌氧发酵表达了低水平生产消旋丙氨酸的能力(Uhlenbusch等，1991)。一株ldh-标记的含有丙氨酸消旋酶突变基因工程乳酸菌在相似方法下发酵1.8％葡萄糖产生12.6g/l L-丙氨酸(H o l s等，1999)。一株双突变大肠杆菌发酵通过好氧和厌氧2个阶段24小时发酵产生32g/l丙氨酸浓度(L
ee等，2004)。随着进一步的筛帅选和过程优化，消旋丙氨酸浓度在更加复杂的反应体系达到88g/l，接近了理论最大值(Smith等，2006)。但是，这种菌株志产生一种消旋丙氨酸，利用多类型质粒需要抗生素的选育，并且需要复杂的介质复杂的多阶段发酵过程(S m i t h等，2006)。
已有的文献及专利有如下报道：
1、L-丙氨酸酶法工业生产的研究
在800升气升式发酵罐上配有假单胞菌Pse.NX-1，获得高L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活。以L-天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产L-丙氨酸，每升培养液可转化L-天冬氨酸2kg，最高达2.5kg，提取得到L-丙氨酸1.2kg，平均收率90％，产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准。(《工业微生物》1997，27(2)，17-20页)；
2、利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸
通过右边筛选得到一株具有高活性L-Asp-β-脱羧酶的菌株
PseudomonasNX-1，对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细的研究，该株可以高效地转化L-Asp生成L-Ala，转化4-5d，每L培养液可转化L-Asp量高达1400g 左右，生成L-Ala浓度高达90％以上，摩尔转化率近100％。(《南京化工学院学报》1995，17(1)，1-6页)；
3、游离细胞法与固定化细胞法生产L-丙氨酸的比较
利用假单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶从L-天冬氨酸为底物生产L-丙氨酸，具有2种方法，一种为游离细胞法，另一种为固定化细胞法。该文比较这2种方法的生产工艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论：采用游离细胞法生产
L-丙氨酸优于固定化细胞法。(《工业微生物》1998，28(1)，38-39，44页)； 4、D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备方法(《中国专利》申请(专利)号：02138553.X；公开(公告)号：CN1405317；公开(公告)日：2003.03.26)
该制备方法是培养假单胞菌属微生物，产生高活力的L-天冬氨酸β-脱羧酶，采用游离细胞法，将含酶细胞或培养液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸盐的溶液混合，32℃-45℃下进行酶反应，然后用等电点结晶结合离子交换树脂法分离反应生成物，得到高化学纯度和光学纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。 5、中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸
采用中空纤维膜反应器，利用假单胞菌P.dacunhaeDQ-pl转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，最适Ph6.0，最适温度30℃，EDTA和Tween-80对细胞产酶有促进作用，游离细胞半衰期为93h。采用对流扩散式中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸，转化率超过90％。(《食品与发酵工业》2003，29(1)，32-35页)；
6、用循环式生物反应器酶法生产L-丙氨酸
用固定化德阿昆合假单胞(Pseudomonas dacunhae)菌体的L-天冬氨酸β-
脱羧酶，在新设计的生物反应器中转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。该反应器能不断缓慢溶解固体L-天冬氨酸，使反应系统的pH和底物浓度维持恒定。用80g
固定化菌体为酶源，在69h内能将4.2kgL-天冬氨酸全部转化生成L-丙氨酸，且仅消耗较少的P L P和氨水。(《药物生物技术》1997，4(4)，212-215页)。 7、丙氨酸发酵法有效生产的原料与方法
UNIVERSITY OF FLORIDA RESEARCH FOUNDTION，INC的Xueli Zhang，Jantama Kaemwich，Moore Jonathan等人在《丙氨酸有效生产的原料与方法》(国际申请号：PCT/US2008/058410)中利用获得的基因工程菌株进行常规发酵糖生产L-丙氨酸。戊糖例如木糖、己糖例如葡萄糖可以用于有效地发酵生产L-丙氨酸。这里描述的菌株具有代谢各种木质纤维生物质能和各种不同糖分的能力，包括乳糖、麦芽糖和蔗糖。利用大肠杆菌采用一种新颖的生物催化剂，在D-乳酸(周
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