(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710300429.6
(22)申请日 2017.05.02
(71)申请人 浙江京新药业股份有限公司
地址 312500 浙江省绍兴市新昌县羽林街
道新昌大道东路800号
申请人 上海京新生物医药有限公司
(72)发明人 李刚 张敏洁 金圣芳
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/10(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种地衣芽孢杆菌的培养基
和发酵方法，培养基中含有磷酸盐和锰盐，能促
进地衣芽孢杆菌快速生长，使芽孢杆菌快速进入
对数生长期，同时能延长菌体生长期，从而大大
提高地衣芽孢杆菌产品产量。该培养基的发酵方
法为种子的活化、一级摇瓶种子培养和发酵罐发
酵培养等步骤。权利要求书1页 说明书5页CN 108795792 A 2018.11.13
C N 108795792
A
1.一种地衣芽孢杆菌培养基，其特征在于，培养基中含磷酸盐和锰盐。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，其主要成分还包括：氮源、碳源和氯化钠。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，氮源选自蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和尿素中的一种或多种，优选蛋白胨；
和/或，碳源选自牛肉膏、玉米淀粉、玉米浆、乳糖、蔗糖和葡萄糖中的一种或多种，优选牛肉膏；
和/或，磷酸盐选自磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种；
和/或，锰盐选自氯化锰或硫酸锰。
4.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述氮源的含量为5～30g/L。
和/或，所述碳源的含量范围为3～7g/L。
和/或，所述无机盐的含量范围为5～15g/L。
和/或，所述磷酸盐的含量范围为0.1～6.0g/L。
和/或，所述锰盐的含量范围为0.03～10.0mg/L。
5.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的主要成分包括：蛋白胨5～30g/L、牛肉膏3～7g/L、氯化钠5～15g/L、磷酸盐0.1g/L～
6.0g/L和锰盐0.03mg/L～10.0mg/L。
6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基的主要成分包括：蛋白胨7～12g/L、牛肉膏4～6g/L、氯化钠7～13g/L、磷酸盐1.0～3.0g/L和锰盐0.03～3.0mg/L。
7.一种地衣芽孢杆菌发酵培养方法，其特征在于，发酵方法如下：
1)种子的活化：将地衣芽孢杆菌种子加入摇瓶肉汤培养；
2)一级摇瓶种子培养：将一定接种量的活化种子接入一级摇瓶培养基进一步培养；
3)发酵罐发酵培养：将一定接种量的一级种子接入权利要求1-6中任一项所述的培养基进行发酵培养。
8.根据权利要求7所述的发酵培养方法，其特征在于，种子的活化和一级摇瓶种子培养条件参数为：温度为30～38℃，转速为120～200r/min，时间为6～8h。
9.根据权利要求7所述的发酵培养方法，其特征在于，发酵培养条件为：发酵装液量为50～60％，所述百分比为体积百分比，温度为30～38℃，罐压为0.03Mpa，通风比为1:0.5～1，溶氧量为20～40％，所述百分比为相对饱和溶解氧的百分比，发酵时间为24h。
10.根据权利要求7所述的发酵培养方法，其特征在于，一级揺瓶种子的接种量为0.5～5％，发酵培养的接种量为20～35％，所述百分比为体积百分比。
权 利 要 求 书1/1页CN 108795792 A
一种地衣芽孢杆菌的培养基和发酵方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种地衣芽孢杆菌的培养基和发酵方法。
背景技术
[0002]地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种包含许多有特殊功能的菌株，在工业、农业、医学等科学领域研究中有广泛的应用价值。目前地衣芽孢杆菌的发酵工艺普遍存在着发酵水平偏低，芽孢形成不一致，产品数量和质量不稳定等缺陷。
[0003]现有技术为了提高地衣芽孢杆菌的发酵水平，一方面，通过发酵培养过程中对发酵工艺的调整如调节发酵温度、压力、时间等工艺条件，从而提高地衣芽孢杆菌产量，但实际操作起来甚为麻烦，同时增加了生产成本，并不能大幅提高产量；另一方面，通过对地衣芽胞杆菌培养基配方进行调整，现有的一般生产地衣芽孢杆菌的培养基配方的主要成分为氮源、碳源、无机盐等，其中无机盐的选择较多，例如钠盐、钾盐、铁盐、镁盐和钙盐等。某些
《微量元素Mn 地芽孢杆菌培养基中添加了少量的磷酸盐或锰盐，但芽孢杆菌生长并不明显，
离子对DY芽孢杆菌芽孢形成影响的研究》(中国微生态学杂志2013年12月第25卷第12期)公开了锰离子能显著提升DY芽孢杆菌发酵过程中芽孢形成率，影响菌体生长曲线，促进芽孢的形成，使菌体活性更高，从而使发酵效果得到显著提升。有关磷酸盐促进地衣芽孢杆菌的快速生长的文献还未见报道。
发明内容
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种地衣芽孢杆菌培养基，该培养基可促进地衣芽孢杆菌快速生长，使芽孢杆菌快速进入对数生长期，同时能延长菌体生长期，从而大大提高芽孢杆菌的产量。
[0005]本发明采用以下技术方案来解决上述技术问题。
[0006]本发明的技术方案为：
[0007]一种地衣芽孢杆菌培养基，该培养基含磷酸盐和锰盐。
[0008]本发明提供的地衣芽孢杆菌培养基主要成分为本领域常规，其主要成分还包括：氮源、碳源和氯化钠。
[0009]本发明提供的地衣芽孢杆菌培养基主要成分为本领域常规。氮源选自蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉和尿素中的一种或多种，优选蛋白胨。碳源选自牛肉膏
、玉米淀粉、玉米浆、乳糖、蔗糖和葡萄糖中的一种或多种，优选牛肉膏。磷酸盐选自磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠中的一种或多种。锰盐可选自氯化锰或硫酸锰。
[0010]本发明中氮源为本领域常规，所述氮源的含量范围较佳地为5～30g/L。
[0011]本发明中碳源为本领域常规，所述碳源的含量范围较佳地为3～7g/L。
[0012]本发明中氯化钠为本领域常规，所述氯化钠的含量范围较佳地为5～15g/L。[0013]本发明中磷酸盐为本领域常规，所述磷酸盐的含量范围较佳地为0.1～6g/L。
[0014]本发明中锰盐为本领域常规，所述锰盐的含量范围较佳地为0.03～10.0g/L。[0015]较佳地，所述培养基的主要成分包括：蛋白胨5～30g/L、牛肉膏3～7g/L、氯化钠5～15g/L、磷酸盐0.1g/L～6.0g/L和锰盐0.03mg/L～10.0mg/L。
[0016]更佳地，所述培养基的主要成分包括：蛋白胨7～12g/L、牛肉膏4～6g/L、氯化钠7～13g/L、磷酸盐1.0～3.0g/L和锰盐0.03～3.0mg/L。
[0017]在本发明的一优选实施方式中，所述培养基仅由蛋白胨5～30g/L、牛肉膏3～7g/ L、氯化钠5～15g/L、磷酸盐0.1g/L～6.0g/L和锰盐0.03mg/L～10.0mg/L组成；更佳地，所述培养基仅由蛋白胨7～12g/L、牛肉膏4～6g/L、氯化钠7～13g/L、磷酸盐1.0～3.0g/L和锰盐0.03～3.0mg/L组成。
[0018]本发明提供的地衣芽孢杆菌的发酵培养方法为本领域常规，主要包括菌种的活化、一级摇瓶菌种培养和发酵培养等步骤。发酵培养具体操作步骤如下：
[0019]1)种子的活化：将地衣芽孢杆菌种子加入摇瓶肉汤培养；
[0020]2)一级摇瓶种子培养：将一定接种量的活化的种子接入一级摇瓶培养基进一步培养；
[0021]3)发酵培养：将一定接种量的一级种子接入进行发酵培养。
[0022]本发明所述的地衣芽孢杆菌种子活化的条件可以是常规的，较佳的，温度为30～38℃，转速为120～200r/min，时间为6～8h。
[0023]本发明所述的一级揺瓶种子的接种量可以是常规的，较佳的接种量为0.5％～5％，所述百分比为体积百分比。一级摇瓶种子培养的条件可以使常规的，较佳的，温度为30～38℃，转速为120～200r/min，摇瓶培养时间为6～8h。
[0024]本发明所述的发酵培养的接种量可以是常规的，较佳的接种量为20～35％，所述百分比为体积百分比。发酵培养的条件参数可以是常规的，较佳的，发酵罐容量为15L，发酵液的装液量为50～60％，所述百分比为体积百分比，发酵温度为30～38℃，罐压为0.03Mpa，通风比为1:0.5～1，溶氧量为20～40％，所述百分比为相对饱和溶解氧的百分比，发酵时间为24h。
[0025]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0026]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0027]本发明的有益效果在于：
[0028]地衣芽孢杆菌培养基成分来源易得且价格便宜、工艺参数简单，培养基中同时添加磷酸盐和锰盐能促进地衣芽孢杆菌快速生长。使芽孢杆菌快速进入对数生长期，同时能延长菌体生长期，从而大大提高芽孢杆菌的产量。
具体实施方式
[0029]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0030]下述实施例中，用到的地衣芽孢杆菌种子来源浙江京新药业股份有限公司，批号20161115-25。发酵培养基中所用的水均为纯化水。
[0031]对比实施例1：空白对照组
[0032]安瓿管种子用纯化水溶解后，加入到摇瓶肉汤培养，500ml三角瓶装液150ml，在37.5℃，180r/min的条件下摇瓶活化6h；按0.1％接种量将摇瓶活化的种子接入一级摇瓶培养基，1000ml三角瓶装液300ml，在37.5℃，180r/min的条件下摇瓶培养6h。一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化钠10g/L；按照30％的接种量将一级种子转入15升发酵罐进行发酵，发酵装液量60％。在发酵37.5℃，罐压0.03Mpa，通风比1:0.8，溶氧量30％条件下发酵24h。发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化钠10g/L。发酵液经离心后，菌体湿重为4.0g/L，芽孢率30％以下。
[0033]对比实施例2：锰盐0.03mg/L
[0034]安瓿管种子用纯化水溶解后，加入到摇瓶肉汤培养，500ml三角瓶装液150ml，在34℃，180r/min的条件下摇瓶活化6h；按0.5％接种量将摇瓶活化的种子接入一级摇瓶培养基，1000ml三角瓶装液300ml，在34℃，200r/min的条件下摇瓶培养6h。一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化钠10g/L；按照20％的接种量将一级种子转入15升发酵罐进行发酵，发酵装液量60％。在发酵34℃，罐压0.03Mpa，通风比1:0.8，溶氧量20％条件下发酵24h。发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和一合水硫酸锰0.03mg/L。发酵液经离心后，菌体湿重为4.2g/L，芽孢率40％以下。
[0035]对比实施例3：锰盐0.3mg/L
[0036]对比实施例3的发酵培养条件参数同对比实施例2完全一样，区别仅在于：发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和一合水硫酸锰0.3mg/L。发酵液经离心后，菌体湿重为4.7g/L，芽孢率60％以下。
[0037]对比实施例4：锰盐3.0mg/L
[0038]对比实施例4的发酵培养条件参数同对比实施例2完全一样，区别仅在于：发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和一合水硫酸锰3.0mg/L。发酵液经离心后，菌体湿重为4.0g/L，芽孢率70％以下。
[0039]对比实施例5：锰盐10.0mg/L
[0040]对比实施例5的发酵培养条件参数同对比实施例2完全一样，区别仅在于：发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和一合水硫酸锰10.0mg/L。发酵液经离心后，菌体湿重为3.2g/L，芽孢率60％以下。
[0041]对比实施例6：磷酸盐0.1g/L
[0042]安瓿管种子用纯化水溶解后，加入到摇瓶肉汤培养，500ml三角瓶装液150ml，在30℃，150r/min的条件下摇瓶活化7h；按1％接种量将摇瓶活化的种子接入一级摇瓶培养基，1000ml三角瓶装液300ml，
在30℃，150r/min的条件下摇瓶培养7h。一级摇瓶培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和纯化水。按照30％的接种量将一级种子转入15升发酵罐进行发酵，发酵装液量60％。在发酵温度30℃，罐压0.03Mpa，通风比1:0.6，溶氧量30％条件下发酵24h。发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和磷酸氢二钾0.1g/L。发酵液经离心后，菌体湿重为6.2g/L，芽孢率30％以下。
[0043]对比实施例7：磷酸盐1.0g/L
[0044]对比实施例7的发酵培养条件参数同对比实施例6完全一样，区别仅在于：发酵培养基的成分包括蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、氯化钠10g/L和磷酸氢二钾1.0g/L。发酵液经离心后，菌体湿重为7.3g/L，芽孢率30％以下。
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