[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1606616A [43]公开日2005年4月13日
[21]申请号02825526.7[22]申请日2002.12.13
[21]申请号02825526.7
[30]优先权
[32]2001.12.20 [33]DK [31]PA200101928
[86]国际申请PCT/EP2002/014179 2002.12.13
[87]国际公布WO2003/054175 EN 2003.07.03
[85]进入国家阶段日期2004.06.18[71]申请人巴法里安诺迪克有限公司
地址丹麦克维斯特加德
[72]发明人卡尔·赫勒 贾塔·克拉默
[74]专利代理机构北京市柳沈律师事务所代理人巫肖南 封新琴
[51]Int.CI 7C12N 7/02C12N 15/86A61K 39/275
权利要求书 2 页 说明书 27 页 附图 1 页
[54]发明名称
[57]摘要
本发明涉及从感染细胞中回收痘病毒的方法，
将病毒感染细胞进行高压匀浆以获得含病毒匀浆物。
对含病毒匀浆物处理至少一次纯化步骤以获得痘病
毒富集部分。本发明进一步涉及根据本发明的方法
获得的含病毒部分和含病毒匀浆物。
02825526.7权 利 要 求 书第1/2页
1.一种从感染细胞中回收痘病毒的方法，包括如下步骤，将感染细胞
进行高压匀浆处理以获得含痘病毒匀浆物。
2.根据权利要求1中的方法，其特征在于所述痘病毒选自由正痘病毒、 禽痘病毒、猪痘病毒和山羊痘病毒构成的组。
3.根据权利要求1～2中任一项的方法，其特征在于所述痘病毒选自痘苗病毒、山羊痘病毒、绵羊痘病毒、金丝雀痘病毒和家禽痘病毒。
4.根据权利要求3中的方法，其特征在于痘苗病毒是Elstree或改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，尤其是保藏号为ECACC V00083008的MVA-BN。
5.根据权利要求1～4中任一项的方法，其特征在于痘病毒为重组痘病毒。
6.根据权利要求1～5中任一项的方法，其特征在于通过将被感染细胞置于高压腔中、提高腔中压力并将
被感染细胞经喷嘴射出进行高压匀浆。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于腔中的压力值升至200至1000巴范围。
8.根据权利要求6～7中任一项的方法，其特征在于喷嘴直径范围为0.10至0.6mm。
9.根据权利要求1～8中任一项的方法，其特征在于将含痘病毒的匀浆物经至少一次纯化步骤以获得痘病毒富集部分。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于该至少一次纯化步骤是超滤步骤。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于该超滤为交叉流过滤。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于交叉流过滤步骤中所使用的
膜具有大于500kDa但等于或小于0.1μm的孔径。
13.根据权利要求10～12中任一项的方法，其特征在于超滤后进行至
少一次柱层析步骤。
14.根据权利要求1～13中任一项的方法，其特征在于对含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分进行冷冻干燥。
15.根据权利要求1～14任一方法获得的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
02825526.7权 利 要 求 书 第2/2页
16.用作疫苗的如权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分。
17.如权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分用于制备疫苗
的用途。
18.根据需要接种包括人在内的动物的方法，其特征在于向动物体施
以权利要求15的含痘病毒匀浆物或痘病毒富集部分或权利要求16的疫苗。
02825526.7说 明 书第1/27页
从感染细胞中回收和纯化痘病毒的方法
本发明涉及从感染细胞中回收痘病毒(p o x v i r u s)，特别是改良的安卡拉痘苗病毒(痘苗病毒A n k a r a，M V A)，的方法。根据本发明，将痘病毒感染细胞进行高压匀浆作用以获得含痘病毒的匀浆物。可将含痘病毒的匀浆物进行至少一个纯化步骤以获得痘病毒富集部分。本发明进一步涉及根据本发明方法获得的含痘病毒部分和含痘病毒的匀浆物。
发明背景
痘病毒科(p o x v i r i d a e)由在脊椎动物和无脊椎动物细胞质中复制的庞大复杂D N A病毒家族组成。痘病毒科可分为c h o r d o p o x v i r i n a e(脊椎动物痘病毒)和entomopoxvirinae(昆虫痘病毒)两个亚科。
脊椎动物痘病毒包括几种具有重要经济价值的动物痘病毒(分类于不同的属)，例如骆驼痘病毒(camelpox viruses)、绵羊痘病毒(sheeppox
v i r u s)、山羊痘病毒(g o a t p o x v i r u s)或禽痘病毒(a v i p o x v i r u s e s)，尤其是家禽痘病毒(f o w l p o x v i r u s)。对于预防绵羊天花和山羊天花的家畜接种，可使用减毒活病毒或灭活病毒。对于家禽接种已经开发了以禽痘病毒为载体的重组疫苗。
由于痘病毒可感染人类细胞，因此推测也可将其用作在人体中表达异源基因的载体并诱导相应的免疫反应。U S 5736368和U S 6051410公开了基因组中含有HIV基因的家禽痘病毒。
到目前为止，作为正痘病毒属成员之一的天花病毒是人类最重要的痘病毒。同为痘病毒科正痘病毒属成员之一的痘苗病毒被用作抵御天花的活疫苗。全世界范围内用痘苗病毒进行的成功接种使天花病毒彻底根除(T h e global eradication of smallpox。Final report of the global commission f o r t h e c e r t i f i c a t i o n o f s m a l l p o x e r a d i c a t i o n；H i s t o r y o f P u b l i c H e a l t h，N o.4，G e n e v a：W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n，1980)。自W H O宣布之后，除面临高度感染痘病毒危险的人员(例如实验室工作人员)之外接种已经中断了许多年。由于痘苗病毒可能具有被用于生物战争或被生物
02825526.7说 明 书 第2/27页利用的危险，使得接种计划再次引起人们的兴趣。
最近，痘苗病毒也已经被用于工程化重组基因表达病毒载体以及作为潜在的重组活疫苗(M a c k e t t，M.，S m i t h，G.L.和M o s s，B.[1982]P.N.A. S.USA 797415 7419；Smith，G.L.，Mackett，M.和Moss，B.[1984]
B i o t e c h n o l o g y a n d G e n e t i c E n g i n e e r i n g R e v i e w s 2，383～407)。这需要借助D N A重组技术将编码所导入外源抗原的D N A序列导入痘苗病毒基因组中。如果该基因整合至病毒D N A上某个病毒生命周期非必需位点，那么该新产生的重组痘苗病毒就可能具有感染性，也就是说能够感染异种细胞并因此表达整合的DNA序列(EP专利申请No.83286和No.110385)。一
方面，以这种方式制备的重组痘苗病毒可用作预防传染病的活疫苗，另一方面，也可用于在真核细胞中
制备外源蛋白质。
为开发重组活疫苗，痘苗病毒作为载体的用途受到安全问题及法规的影响。文献中描述的大部分重组痘苗病毒都是以痘苗病毒W e s t e r n R e s e r v e s t r a i n为基础的。由于该毒株公知具有强神经毒性因而极不适于在人和动物中使用(M o r i t a e t a l.，V a c c i n e 5，65～70[1987])。另一方面，改良的安卡拉痘苗病毒(M V A)却公知是特别安全的。M V A为痘苗病毒安卡拉株(C V A)在鸡胚成纤维细胞上经长期连续传代获得(参见M a y r，A.的综述，H o c h s t e i n-M i n t z e l，V.和S t i c k l，H.[1975]I n f e c t i o n 3，6-14；瑞士专利N o.568 392)。按布达佩斯条约要求保藏的M V A病毒株有保藏在位于S a l i s b u r y(U K)的欧洲动物细胞保藏中心(E u r o p e a n C o l l e c t i o n o f A n i m a l C e l l C u l t u r e s，E C A C C)的毒株M V A 572、M V A 575和M V A-B N，保藏编号分别为E C A C C V94012707、E C A C C V00120707和E C A C C V00083008。M V A之所以特别是由于其极大的减毒作用，也即具有削弱的毒性或感染性但却同时保持良好的免疫原性。为鉴定M V A病毒基因组中相对于野生型C V A毒株的变化已经对MVA病毒进行了分析。已鉴定出6个主要基因组DNA缺失(缺
失I、I I、I I I、I V、V和V I)，共计31,000个碱基对(M e y e r，H.，S u t t e r，G.和Mayr A.[1991]J.Gen.Virol.，72，1031～1038)。所形成的MVA
病毒严格限制于鸟类宿主细胞。此外，M V A的特征在于其极端的减毒作用。用多种动物模型进行试验
证明，M V A甚至在免疫抑制动物中都是无毒的。更重要的是，M V A的优越特性已经在广泛的临床试验中得到了证明(M a y r e t a l.，Z b l.B a k t.H y g.1，A b t.O r g.B 167 375～390[1987]，S t i c k l e t
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议