(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811536761.3
(22)申请日 2018.12.14
(71)申请人 广西大学
地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡
塘区大学东路100号
申请人 广西南宁市桃源兽药厂
(72)发明人 司红彬 覃燕灵 沈水宝 赵雨川
王莉贞 王晓晔 孙坚 陈海兰
杨帆 韦英明 刘一鸣 陆凤琪
(74)专利代理机构 深圳新创友知识产权代理有
限公司 44223
代理人 关文龙
(51)Int.Cl.
C12Q 1/689(2018.01)
C12Q 1/04(2006.01)
A61K 35/74(2015.01)A61K 49/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)
(54)发明名称感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建及病情判断方法(57)摘要本发明公开了一种感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建及病情判断的方法，尤其采用大肠杆菌建立小鼠菌血症疾病模型，通过建立观察的症状与体内血液降钙素原之间的关系，首次创新的将小鼠菌血症疾病发展程度科学的分为6级，以便于判断菌血症动物疾病模型的疾病发展程度，为疾病的发展、药物的筛选及疗效的科学评价打下较好的构建模型基础。采用该方法可以较好科学、快速、准确的判断出小鼠发病的严重程度及情况，较好的补充了仅仅以死亡率作为模型构建指标及判断筛选药物疗效不够敏感和准确的弊端，该模型的建立方法为为菌血症的药物筛选模型成功构建提供了一种便捷、快速、 准确的判断方法。权利要求书1页 说明书5页 附图8页CN 109576383 A 2019.04.05
C N 109576383
A
1.一种感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：临床收集患有大肠杆菌疾病畜禽的病料，划线接种于麦康凯筛选培养基，37℃过夜培养；
S2：挑取单个的菌落，继续分离培养；
S3：对S2培养的菌落革兰氏染与镜检，初步确定为大肠杆菌；
S4：肠杆菌科的细菌生化鉴定管进行鉴定，确定分离细菌为大肠杆菌；
S5：用fosA3、CTX -M、TEM、SHV等耐药基因的引物进行扩增，确定分离的耐药大肠杆菌的耐药基因型，再用小鼠回归实验确定其致病性；
S6：原菌液划麦康凯琼脂平板，挑选单个菌落，接种到液体培养基中过夜培养；
S7：测定每毫升的细菌数，并将其菌液稀释；
S8：选取18-22g小鼠10只，分为空白对照组和疾病模型构建组；
S9：疾病模型组按0.1ml/10g进行腹腔注射，注射菌液浓度为2.0x107CFU/mL，在各个阶段观察临床指标，观察小鼠疾病发展程度。
2.根据权利要求1所述的感染细菌性败血症小鼠疾病模型的病情判断方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)观察其致病情况，根据病情发展将症状分为6期进行打分；
(2)打分标准：①正常组，反应比较活泼，行为状态都比较正常为0分；②反应迟钝，未出现其他体征为1分；③无精打采，眼球浑浊，体毛粗乱为2分；④趴着不动，眼睛无法睁开，眼干，无分泌物为3分；⑤
眼肿，且有白透明分泌物为4分；⑥眼肿，且有白透明分泌物为5分；⑦剧烈抽搐，半小时内死亡为6分。
3.根据权利要求1所述感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于所述临床指标如下：
在每个阶段分别采血，检测中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板数、白细胞数、降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子(TNF -α)、白介素-1α(IL -1α)、白介素-6(IL -6)，建立每个阶段症状与血液生化指标的关系，即该模型根据症状再结合血液指标，可以科学判断疾病发展程度。
4.根据权利要求1所述的感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于：步骤S2中的培养基为LB培养基。
5.根据权利要求1所述的感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于：步骤S6中的培养基为LB培养基。
6.根据权利要求1所述的感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于：步骤S7中的细菌的浓度为2.0x107CFU/mL。
7.根据权利要求1所述的感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于：步骤S8中的小鼠为昆明小鼠。
8.根据权利要求1所述的感染细菌性菌血症小鼠疾病模型的构建方法，其特征在于：步骤S9的注射的时间为20分钟内完成，注射1次。
权 利 要 求 书1/1页CN 109576383 A
感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建及病情判断方法
技术领域
[0001]本发明属于大肠杆菌引起的菌血症感染技术领域，尤其涉及一种感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建及病情判断方法。
背景技术
[0002]菌血症是指外界的细菌经由体表的入口或是感染的入口进入血液系统后，在机体血液内繁殖并随血流在全身播散，是机体感染的严重炎症反应，是全球重症监护病房的发病率和死亡率的主要原因；也是我国乃至全世界急危重症领域普遍面临的难题。在耐药性细菌增多的大环境下，无疑对ICU病房来讲更是雪上加霜，在许多文献报道医院所有败血症发生的案例中，因耐药大肠杆菌感染而引起的菌血症竟占40％以上，尤其是因产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBL)耐药大肠杆菌导致的菌血症死亡率更高。大肠杆菌是常见的条件致病菌，也是常发的一种疾病，它可原发引起鸡急性败血
症、腹膜炎、肝炎、肺炎、肠炎等多部位严重全身感染，亦可继发或混发于病毒病，给养殖业造成巨大的经济损失。阿莫西林、氨苄西林、头孢噻呋、头孢曲松、阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦等β-内酰胺环类抗生素是防治该病的常用的重要药物，随着养殖规模集约化程度愈来愈大，用药愈来愈泛滥，其耐药菌株愈来愈多，关于大肠杆菌耐药性的报道也较多。研究证实，耐药的主要机制之一是产生β-内酰胺酶，尤其是超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，该酶能较强和快速地水解β-内酰胺环，使这类抗生素丧失抗菌活性。ESBLs是β-内酰胺酶的最主要酶型，它不仅对头孢三代和氨曲南耐药，而且对氨基糖苷类、喹诺酮类和磺胺类呈交叉耐药，仅对碳青霉烯类、头霉烯类药物敏感。许多文献已经报道大肠杆菌的多重耐药性与产生ESBLs有密切关系，国内外对之较为关注。发明人最近开展了食品动物源致病菌ESBLs的检测、提取、酶对抗生素的水解率及舒巴坦、他唑巴坦以及中药的抑酶保护作用等研究，对部分ESBLs大肠杆菌的药敏试验表明，其多重耐药率明显高于非ESBLs菌株。细菌的耐药性造成养殖户耐药菌引起的菌血症疾病时用药成本增加，疗程延长，畜禽死亡率增加，给生产带来较大经济损失，并且增加畜禽药物残留风险。因此，实际生产中亟需建立一种败血症疾病模型，用于败血症疾病的药物筛选和研发，感染耐药菌性败血症小鼠疾病模型的构建以及同时可以对病情进行科学判断方法，目前还未见报道。
发明内容
[0003]本发明的目的是针对现有构建模型及病情判断技术的不足，提供一种感染耐药性细菌败血症小鼠
疾病模型的构建及病情判断的方法，具体技术方案如下：
[0004]一种感染细菌性败血症小鼠疾病模型的构建方法，包括以下步骤：
[0005]S1：临床收集患有大肠杆菌疾病畜禽的病料，划线接种于麦康凯筛选培养基，37℃过夜培养；
[0006]S2：挑取单个的菌落，继续分离培养；
[0007]S3：对S2培养的菌落革兰氏染与镜检，初步确定为大肠杆菌；
[0008]S4：肠杆菌科的细菌生化鉴定管进行鉴定，确定分离细菌为大肠杆菌；
[0009]S5：用fosA3、CTX-M、TEM、SHV等耐药基因的引物进行扩增，确定分离的耐药大肠杆菌的耐药基因型，再用小鼠回归实验确定其致病性；
[0010]S6：原菌液划麦康凯琼脂平板，挑选单个菌落，接种到液体培养基中过夜培养；[0011]S7：测定每毫升的细菌数，并将其菌液稀释；
[0012]S8：选取18-22g小鼠10只，分为空白对照组和疾病模型构建组；
[0013]S9：疾病模型组按0.1ml/10g进行腹腔注射，注射菌液浓度为2.0x107CFU/mL，在各个阶段观察
临床指标，观察小鼠疾病发展程度。
[0014]优选地，所述的感染细菌性败血症小鼠疾病模型的病情判断方法，包括以下步骤：[0015](1)观察其致病情况，根据病情发展将症状分为6期进行打分；
[0016](2)打分标准：①正常组，反应比较活泼，行为状态都比较正常为0分；②反应迟钝，未出现其他体征为1分；③无精打采，眼球浑浊，体毛粗乱为2分；④趴着不动，眼睛无法睁开，眼干，无分泌物为3分；⑤眼肿，且有白透明分泌物为4分；⑥眼肿，且有白透明分泌物为5分；⑦剧烈抽搐，半小时内死亡为6分。
[0017]优选地，所述临床指标如下：
[0018]在每个阶段分别采血，检测中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、血小板数、白细胞数、降钙素原(PCT)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-6(IL-6)，建立每个阶段症状与血液生化指标的关系，即该模型根据症状再结合血液指标，可以科学判断疾病发展程度。
[0019]优选地，步骤S2中的培养基为LB培养基。
[0020]优选地，步骤S6中的培养基为LB培养基。
[0021]优选地，步骤S7中的细菌的浓度为2.0x107CFU/mL。
[0022]优选地，步骤S8中的小鼠为昆明小鼠。
[0023]优选地，步骤S9的注射的时间为20分钟内完成，注射1次。
[0024]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：首先选取临床分离菌株进行分离鉴定，然后对其耐药基因进行鉴定，挑选单个菌落，接种到液体培养基中过夜培养，测定每毫升的细菌数，并将其菌液稀释到一定的浓度，选取18-22g昆明小鼠，分为空白对照组和疾病模型构建组，疾病模型组按0.1-0.2ml/10g进行腹腔注射，观察其致病情况。先建立攻毒菌液的半数致死量。正式实验时选取体重为18-20g的小鼠，平均分为对照组及注射组，注射组小鼠注射菌液浓度为2.0x107CFU/mL，根据病情发展将症状分为6期进行打分，并把每个阶段的小鼠分别采血，检测每个阶段的血液生化指标，建立病情症状6个阶段与血液生化指标之间的对应关系，进而科学判断菌血症模型构建的成功及疾病发展严重程度。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0026](1)本发明建立的细菌败血症小鼠疾病模型的构建及病情判断的方法是针对于感染耐药性大肠杆菌，引起的细菌性败血症。
[0027](2)不仅可以为菌血症研究提供科研指导，还可以用于菌血症药物的筛选及给药剂量的判断，该疾病模型的构建为畜牧养殖业科学，健康的发展奠定一定的基础。[0028](3)本发明采用白细胞数目、
淋巴细胞数目、单核细胞、中性粒细胞、血小板数目、降钙素原等理化指标作为感染细菌性败血症小鼠模型的病情判断方法，当百分比差异比较
显著，这些生化指标可以很好的反应疾病发展程度，尤其降钙素原与6期打分有很好的对应关系，可以较好的反应疾病模型症状、疾病严重程度与血液指标的关系。
附图说明
[0029]图1：同时含fosA3(1)和CTX-M(2)菌株；
[0030]图2：同时含CTX-M(1)和MCR-1(2)菌株；
[0031]图3：反应迟钝，未出现其他体征为1分；
[0032]图4：反应迟钝，未出现其他体征为1分；
[0033]图5：无精打采，眼球浑浊，体毛粗乱为2分；
[0034]图6：趴着不动，眼睛无法睁开，眼干，无分泌物为3分；
[0035]图7：眼肿，且有白透明分泌物为4分；
[0036]图8：眼肿，且有白透明分泌物为5分；
[0037]图9：剧烈抽搐，半小时内死亡为6分；
[0038]图10：剧烈抽搐，半小时内死亡为6分；
[0039]图11：中性粒细胞差异图；
[0040]图12：淋巴细胞数目差异图；
[0041]图13：单核细胞差异图；
[0042]图14：血小板数目差异图；
[0043]图15：白细胞数目差异图；
[0044]图16：降钙素原差异图；
[0045]图17：TNF-α差异图；
[0046]图18：1L-1α差异图；
[0047]图19：1L-6差异图。
[0048]具体实施方式如下
[0049]下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0050]一、具体实施例
[0051]实施例1
[0052]取已经确定含有耐药基因的大肠杆菌，挑取单个菌落，过夜培养，然后进行稀释至2.0x107CFU/mL；选取18-22g昆明小鼠，分为空白对照组和不同剂量攻毒的疾病模型构建组，疾病模型组按0.1-0.2ml/10g进行腹腔注射，进行预实验，先建立攻毒菌液的半数致死量。正式实验时选取体重为18-20g的小鼠，按情况分为对照组10只及疾病模型组20只，疾病模型组按0.1-0.2ml/10g体重小鼠腹腔注射菌液浓度为2.0x107CFU/mL大肠杆菌，记录时间，根据体征变化特点划分病程。根据病情严重程度，用1～6分进行评分。评分办法按下述办法进行计分。
[0053]二、小鼠菌血症疾病模型构建及病情判断
[0054]1材料与方法
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