[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101226200A
[43]公开日2008年7月23日
[21]申请号200710056485.6[22]申请日2007.01.19
[21]申请号200710056485.6
[71]申请人天津天美生物技术有限公司
地址300457天津市经济技术开发区第三大街翠
亨村A3楼2506室
[72]发明人苏殿杰 魏桂梅 韩苏 [51]Int.CI.G01N 33/68 (2006.01)G01N 21/76 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 5 页
[54]发明名称
钙蛋白T超敏感方法
[57]摘要
本发明是关于用化学发光免疫分析检测人cTnT
的方法。用吖啶酯和/或碱性磷酸酶作为标记物。
免疫反应采用双单抗夹心法和/或竞争法。为了提
高敏感度，免疫反应优选链霉亲合素－生物素双单
抗夹心一步法。用NaOH、H 2O 2作为吖啶酯发光启动
剂；用1，2－二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)作
为碱性磷酸酶的发光底物，用荧光素衍生物、表面
活性剂作为发光增强剂。固相载体采用微孔板、高
分子聚合物管(球)、四氧化三铁磁微粒等。
200710056485.6权 利 要 求 书第1/1页
1.心肌钙蛋白T(cTnT)化学发光免疫分析方法，其特征在于用吖啶酯和/或碱性磷酸酶化
学发光免疫分析体系检测cTnT。
2.根据权利要求1所述cTnT化学发光免疫分析方法，其特征在于用双单抗夹心法和/或竞
争法；固相载体采用微孔板、高分子聚合物管(或球)、磁微粒等；测定手段采用全自动
检测法或半自动检测法。
3.根据权利要求1所述吖啶酯化学发光免疫分析体系，其特征在于用吖啶酯作为标记物，用碱性H2O2作为发光启动剂。
4.根据权利要求1所述碱性磷酸酶化学发光免疫分析体系，其特征在于用碱性磷酸酶作为标记物；用1，2-二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)作为碱性磷酸酶的底物；用荧光素
衍生物和表面活性剂作为发光增强剂。
200710056485.6说 明 书第1/5页吖啶酯和碱性磷酸酶化学发光免疫分析检测心肌钙蛋白T超敏感方法
技术领域
本发明属于临床免疫分析领域，建立吖啶酯、碱性磷酸酶为标记物的化学发光免疫分析检测心肌肌钙蛋白T的方法，以早期、敏感、特异地诊断急性心肌梗死。此外本发明也可用于实验室作生理、病理、药理、分子生物学等多项研究。 技术背景
心血管疾病是常见病和多发病，是威胁人类健康的首要疾病。急性心肌梗死(a c u t e myocardial infarction，AMI)是常见的心血管疾病。正确诊断及时救治对挽救濒死心肌，降低急性期病死率，改善预后具有重要意义。在A M I的诊断方面，常用的心电图诊断的准确度仅为24-60％(al.Instability of ST segments in the early stages of acute myocardial infarction in patients undergoing continuous 12-Lead ECG monitoring.Am J Emerg Med，1995，13：158～163)，远达不
到临床要求。在生化诊断方面，肌酸激酶(CK)及其同工酶(C K-M B)、乳酸脱氢酶(L D H)等是目前常用的心肌酶谱。但是心肌酶谱并非心脏所特有，在正常人骨骼肌中也有少量存在。非心脏手术或骨骼肌损伤患者C K-M B也可升高，且C K-M B 在A M I发病后4-8小时才开始升高，持续时间较短(48-72小时)，临床应用受到限制。1987年英国C u m m i n s等首先报告了用测定周围血中心肌钙蛋白(c T n)的含量用以诊断A M I (C u m m i n s，e t a l.i n f a r c t i o n A m h e a r t J，1987，113：1333-1334)。1991年K a t u s等人报道了cTnT对诊断AMI具有高度敏感性和特异性(clin.chem.1991；83：902-912.)。近年来研究表明，心肌肌钙蛋白(C a r d i a c T r o p o n i n)是心肌特异的调节蛋白，其亚单位肌钙蛋白T (c T n T)和肌钙蛋白I(c T n I)在A M I时释放入血是心肌损伤的特异性标志物，并具有灵敏度高，在血中出现时间早，诊断窗口时间长等优点。此外c T n T在预测梗塞面积，评价溶栓疗效，A M I预后心功能判定，不稳定心绞痛预后评估，围手术期心肌损伤的判定等方面均具
有重要的临床价值。
以往学者们对c T n T诊断A M I的特异性有些争论。1991年k a t u s发现c T n T与骨骼肌有1％-2％交叉反应(clin.Chem.1991；83：902-912.)。但也有学者认为cTnT与骨骼肌的基因编码不同，两者在结构和免疫原方面有很大差异。在检测c T n T的方法改进后，用两种均为心肌特异的单克隆抗体检测c T n T时，与骨骼肌交叉反应阳性率＜0.5％(K a t u s H A.e t a l.C l i n.
c h e m.1992，38：386)。B a u m等人对75名无心脏病的骨骼肌患者(其中33名D u c h e n n e病，42例马拉松运动员长跑后)用改进后的检测方法检测其c T n T，未发现阳性反应(B o
d o r G S. etal.Clin.chem.1992，38：2203.)。由此可以认为，在无心脏病的骨骼肌患者的血浆中及运动员的血浆中未发现c T n T存在，所以c T n T对诊断急性心肌梗死与c T n I同样具有心肌特异性。然而当发生A M I时，c T n T在升高倍数和持续时间上优于c T n I。由于c T n T在正常人血清中含量很低，在心肌细胞中含量高，一旦少量释放入血浆，c T n T即可升高30-200倍，而c T n I 仅升高10-20倍(杨振华：中华医学杂志。1992，72(1)51-52)。另外c T n T在血液和淋巴液中消除速率慢，AMI时cTnT升高可持续2-3周，较cTnI持续时间长。
因为c T n T在血浆中正常含量很低，测定方法需具备较高的灵敏度和很低的检测下限。最初建立的E L I S A检测血清c T n T的方法是基于用亲和纯的一种多抗和一种单抗，以后又发展了更敏感更特异的E L I S A双单抗一步法，整个反应90分钟完成，检测范围0.1-15μg/L。由于全部采用单抗，检测结果重复性较高，与骨骼肌交叉反应＜0.5％(al.Clin. chem.1992，38：386)。快速定性测定方法采用金免疫层析法(郑佐娅，陶义训，上海医学检验杂志，1996，11，57-58。)。
1977年A r a k a w e创建了化学发光免疫分析(C h e m i l u m i n e s c e n t i m m u n o a s s a y，C L I A)。该方法可以使检测范围达到6个数量级，并且敏感度可达10的负18次方摩尔水平。根据标记物的不
同，化学发光免疫分析可分以下三个类型：(1)以辣根过氧化物酶(H R P)为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为二酰基肼的衍生物，在氧化剂存在下，H R P催化二酰基肼衍生物发光，波长425n m。苯酚类化合物可增强其发光强度。(2)以碱性磷酸酶为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1，2-二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生物)。例如A M P P D、C S P D、C D P-S t a r、L u m i-p h o s480、L u m i p h o s-530等。荧光素衍生物和表面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470n m。(3)以吖啶酯类为标记物的化学发光系统。该系统不需酶催化，不需增强剂，吖啶酯类在碱性H2O2作用下直接发光，波长430n m。吖啶酯类发光系统发光强度高，反应干扰因素少，背景发光低，信噪比高，具有较高的灵敏
度。吖啶酯类发光系统是一类很有效的化学发光系统。
发明内容
吖啶酯、碱性磷酸酶为标记物的双单抗夹心发光法检测c T n T：该方法需要同c T n T结合具有不同结合位点的两种单抗。首先需将链霉亲合素固化于固相载体上；然后制备单抗(1)同生物素的复合物；制备单抗(2)同吖啶酯(或碱性磷酸酶)的复合物。检测时将样品(或标准品)、单抗(1)同生物素的复合物、单抗(2)同吖啶酯(或碱性磷酸酶)的复合物一起加入反应池，通过一步反应后生成如下复合物：固相载体-链霉亲合素-生物素-单抗(1) -c T n T-单抗(2)-吖啶酯(或碱性磷酸酶)，经洗涤后，吖啶酯标记物加入发光启动剂便可发光；碱性磷酸酶标记物加入其底物和增强剂便可发光。
吖啶酯(或碱性磷酸酶)为标记物的竞争发光法检测c T n T：首先将单抗(1)固化于固相载体上作为扑捉抗体。然后制备吖啶酯(或碱性磷酸酶)标记c T n T的复合物。检测时将样品(或标准品)、吖啶酯(或碱性磷酸酶)标记的c T n T复合物一起加入反应池，反应后经洗涤，吖啶酯的标记物加入发光启动剂便可发光；碱性磷酸酶的标记物加入其底物和增强剂便可发光。
有效的吖啶酯类化合物有吖啶酯D M A E-N H S、吖啶磺酰胺、吖啶酯A E、双吖啶(D M D S B A)等，其发光启动剂为碱性H2O2； 碱性磷酸酶的底物有1，2-二氧环乙烷衍生物(金刚烷衍生物)，例如A M P P D、C S P D、C D P-S t a r等。发光增强剂有荧光素、表面活性剂等。
酶促化学发光免疫分析法可采用全自动检测仪，也可采用半自动发光仪。根据需要，固相载体可选用多孔板、高分子聚合物管(或球)、磁微粒等。
碱性磷酸酶标记抗体，生物素标记抗体已成常规方法，参照下述文献进行：
1、J.A，Arends，J.Immuno.Methods，1997，25：171。
2、D.M.Boorana，etal.J，Immuno.Methods 30：245。
3、J.Immunological Methods，1979，31：231-236。
4、J.Histochem.Cytochem，1979，22：1084-1091。
5、尹伯元、王仁芝、李振甲、许以平等编著《标记免疫学》：41-50页。
6、Peters JH，Baumgarten H eds.Monoklonale
1988：1349-53。
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