(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811644223.6
(22)申请日 2018.12.30
(71)申请人 王增艳
地址 262299 山东省潍坊市诸城市南环路
金惠园东区
(72)发明人 王增艳 王萍萍 王增芳 徐洋
闫书山 徐栋花 王菁华
(74)专利代理机构 江苏圣典律师事务所 32237
代理人 杨文晰
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6883(2018.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
A61K 31/7088(2006.01)
A61P 19/02(2006.01)
A61P 29/00(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种m6A甲基化修饰过程中关键
基因(METTL3)的检测及其应用，根据提取的总
RNA序列，设计并合成特异性PCR引物，利用real -
风湿关节炎的疾病活动性指标CRP、ESR呈明显正
相关关系，故METTL3基因可应用于制备类风湿关
发明同时设计并合成特异性过表达该基因的Lv -
METTL3序列，能够通过调控NF -κB信号通路显著
抑制巨噬细胞的增殖及LPS所诱导的巨噬细胞的
炎症反应，可成为类风湿关节炎的分子靶向
工具。权利要求书1页 说明书11页序列表2页 附图5页CN 109457029 A 2019.03.12
C N 109457029
A
1.一种METTL3基因在制备类风湿关节炎检测制剂、制备类风湿关节炎预后评估制剂中的应用。
2.一对用于检测METTL3基因的引物对，该引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.一种类风湿关节炎检测制剂，该试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对。
4.根据权利要求3所述的类风湿关节炎检测制剂，其特征在于，所述检测试剂包括：10ul 2×SYBR Premix Ex Taq II、1.6ul 50×ROX Reference Dye、浓度为2.5ng/ul的cDNA 2ul、浓度均为10umol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各1ul ,，ddH 2O补足至20ul。
5.一种METTL3基因的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)提取样品外周血单个核细胞提取；
2)TRIzol法提取样品总RNA；
3)总RNA浓度和纯度的测定；
4)cDNA合成及PCR反应：
4.1)cDNA合成体系：依次加入5×PrimeScript Buffer，PrimeScript RT Enzyme Mix I，Oligo dT Primer 50μM，Random 6mers 100μM，总RNA0.5ug，DEPC补至20ul；
cDNA合成程序：37℃反应15min；85℃反应5s；即获得cDNA；
4.2)PCR扩增体系：2×SYBR Premix Ex Taq II 10ul，50×ROX Reference Dye
1.6ul，
2.5ng/ul的cDNA 2ul，10umol/L的SEQ ID NO.11ul ,10umol/L的SEQ ID NO.21ul ,ddH 2O补足至20ul；混匀后2000rpm离心20s；
PCR扩增反应程序：95℃反应30秒，95℃反应5秒，60℃反应30秒；40个循环；
5)以GAPDH为作为内参基因，荧光实验结果采用2-ΔΔCT的数据统计方法分析METTL3基因的相对表达。
6.一种METTL3基因在制备类风湿关节炎靶向制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，根据METTL3基因制备特异性过表达序列，用于在细胞中过表达METTL3基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述过表达序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
9.一种类风湿关节炎靶向制剂，该制剂包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的特异性过表达序列。
权 利 要 求 书1/1页CN 109457029 A
METTL3基因的应用及其检测方法
技术领域
[0001]本发明属于风湿病分子生物学领域，具体涉及一种m6A甲基化中关键基因METTL3的表达、应用及其检测方法，具体而言，本发明具体涉及METTL3基因在制备类风湿关节炎辅助诊断制剂、分子靶向制剂或者预后评估制剂中的应用。
背景技术
[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)，是一种常见的病因未明的炎症性、系统性自身免疫性疾病，以对称性手足小关节慢性炎症为主要临床表现，其主要病理特征是滑膜炎和血管炎(Scott DL,et al.Rheumatoid arthritis.Lancet.2010；376:1094-108.)。RA通常会造成关节以外的脏器损伤，例如，肺组织纤维化、心包炎、皮肤出现类风湿结节等(Turesson C.Extra-a rticula r rheuma toid a rthritis.Curr O pin Rheumatol.2013；25:360-366.)。RA具有高度的致畸性和致残性，病程后期严重影响患者的生活品质。RA的发病机制不明，可能与传染、遗传、性激素分泌等有关(Glant TT,et al.Epigenetics in the pathogenesis of rheumatoid arthritis.BMC Med.2014；12: 35；Salemi S,et al.Could ea rly rheuma toid a rthritis resolve af ter p e r i o d o n t i t i s t r e a t m e n t o n l y？:c a s e r e p o r t a n d r e v i e w o f t h e literature.Medicine(Baltimore)2014；93:e195；Ayeldeen G,et al.Possible use of miRNAs-146a and -499 expression and their polymorphisms as diagnostic markers for rheumatoid arthritis.Mol Cell Biochem.2018；449:145-156.)。尽快缓解患者的炎性症状，缓解疼痛，控制病情活动，延缓疾病的进展，减少疾病对患者造成致畸以及致残的伤害是RA的关键。但是，目前RA的药物包括改变病情抗风湿药、糖皮质激素等缺乏靶向性、针对性，长期服药副作用大，病人身体及心理负担重(W e s t h o ve n s R,e t al.Clinical efficacy and safety of abatacept in methotrexate-naive patients with early rheumatoid arthritis and poor prognostic factors.Ann Rheum Dis.2009；68:1870-1877；Bathon J,et al.Sustained disease remission and inhibition of radiographic progression in methotrexate-naive patients with rheumatoid arthritis and poor prognostic factors treated with abatacept:2-year outcomes.
Ann Rheum Dis 2011；70:1949-1956；Goekoop-Ruiterman YP,et al.Clinical and radiographic outcomes of four different treatment strategies in patients with early rheumatoid arthritis(the BeSt study):A randomized, controlled trial.Arthritis Rheum 2008；58:S126-35；Goekoop-Ruiterman YP,et al.Comparison of treatment strategies in early rheumatoid arthritis:a randomized trial.Ann Intern Med 2007；146:406-415.)。因此，寻RA早期诊断、靶向和预后评估的生物标记物分子意义深重。
[0003]随着分子生物学技术的进步及在医学领域的广泛应用，越来越堵的研究者发现，一些循环非编码RNA分子特异性存在于RA患者外周循环中，成为潜在的RA生物标记物，譬如
微小RNA、长链非编码RNA分子等(Dunaeva M,et al.Circulating serum miR-223-3p and miR-16-5p as possible biomarkers of early rheumatoid arthritis.Clin Exp Immunol 2018；193:376-385；Xu D,et al.Exosome-encapsulated miR-6089 regulates inflammatory response via targeting TLR4.J Cell Physiol.2019；234:1502-1511；Davis JM,et al.My treatment approach to rheumatoid arthritis.Mayo Clin Proc.2012；87:659-673；Zhang Y,et al.Long noncoding RNA expression profile in f i b r o b l a s t-l i k e s y n o v i o c y t e s f r o m p a t i e n t s w i t h r h e u m a t o i d arthritis.Arthritis Res Ther.2016；18:227；Yang CA,et al.lncRNA NTT/PBOV1 Axis Promotes Monocyte Differentiation and Is Elevated in Rheumatoid Arthritis.Int J Mol Sci.2018；19.)。RNA作为生命活动中重要的调节分子和修饰分子，也存在着很多种转录后化学修饰。目前经研究已经发现了100多种mRNA核苷酸修饰，其中m6
A甲基化修饰占到了80％左右(Yin X,et al.mRNA-Seq reveals novel molecular mechanisms and a robust fingerprint in Graves' disease.J Clin Endocrinol Metab.2014；99:E2076-83；Wu Y,et al.Mettl3-mediated m(6)A RNA methylation regulates the fate of bone marrow mesenchymal stem cells and osteoporosis.Nat Commun.2018；9(1): 4772；Wu X,et al.N6-methyladenine RNA modification and cancers.Am J Cancer Res.2018；8:1957-1966；Lobo J,et al.The Emerging Role of Epitranscriptomics in Cancer:Focus on Urological Tumors.Genes(Basel).2018；9(11).pii:E552；Anders M, et al.Dynamic m(6)A methylation facilitates mRNA triaging to stress granules.Life Sci Alliance.2018；1:e201800113.)。近年来，m6A甲基化修饰成为肿瘤学、免疫学等领域的研究热点，与免疫、炎症、肿瘤等的调控密切相关(Zhao BS,et al.Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.Nat Rev Mol Cell Biol.2017；18:31-42；Gilbert WV,et al.Messenger RNA modifications:Form, distribution,and function.Science.2016；352:1408-1412.)。
[0004]目前，m6A甲基化修饰在RA等风湿病中的研究报道甚少，其机制更是不明确。在RNA m6A甲基化修饰过程中，目前已知的总共有三种甲基转移酶复合物中具有酶活功能的组分METTL3、METTL14、WTAP，其中METTL3是其中最为重要的一种RNA甲基转移酶。人的METTL3基因位于14q11.2，有9个外显子(Liu J et al.A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation.Nat Chem Biol 2014；10:93-95)。研究发现，METTL3可以通过调控某些关键分子的翻译和
表达、影响免疫炎症细胞的增殖、分化及其功能的发挥(Geula S,et al.Stem cells.m6A mRNA methylation facilitates resolution of pluripotency toward differentiation.Science 2015；347:1002-
1006.)。然而METTL3介导的RNA m6A甲基化修饰过程具有一定的组织和细胞特异性，在不同的组织和细胞中其发挥的作用机制是不同的(Gilbert WV,et al.Messenger RNA modifications:Form,distribution,and function.Science.2016；352:1408-1412；Geula S,et al.Stem cells.m6A mRNA methylation facilitates resolution of
pluripotency toward differentiation.Science.2015；347:1002-1006；Yoon KJ,et a l.T e m p o r a l C o n t r o l o f M a m m a l i a n C o r t i c a l N e u r o g e n e s i s b y m A Methylation.Cell.2017；171:877-889；Meyer KD.Rethinking mA Readers,Writers,and
Erasers.Annu Rev Cell Dev Biol.2017；33:319-342.)。目前，METTL3基因与类风湿关节炎检测、中的应用尚未见报道。
发明内容
[0005]针对目前RA的药物缺乏靶向性、针对性，长期服药副作用大的现状，本发明首先提供了一种METTL3基因在制备类风湿关节炎(RA)检测制剂、制备类风湿关节炎预后评估制剂中的应用。
[0006]其次，本发明提供了一对用于检测METTL3基因的引物对，该引物对核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0007]第三，本发明提供了一种类风湿关节炎检测制剂，该试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对；进一步，该检测试剂包括：10ul 2×SYBR Premix Ex Taq II、1.6ul 50×ROX Reference Dye、2ul cDNA(2.5ng/ul)、浓度为10umol/L的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2各1ul,，ddH2O补足至20ul。
[0008]第四，本发明提供一种METTL3基因的检测方法，包括外周血单个核细胞提取、TRIzol法提取总RNA、RNA浓度和纯度的测定、cDNA合成及PCR扩增，其具体步骤如下：[0009]1、样品外周血单个核细胞提取
[0010]采用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度-梯度离心法PBMCs的分离。取4ml淋巴细胞分离液加入离心管中，吸取样品全血，沿管壁缓慢加于分离液上，二者比例为1：1，然后将离心管置于水平式离心机内，2000rpm离心30min。沿管壁周缘吸出富含单个核细胞的白膜层，移入另一离心管中，加入PBS洗涤，1500rpm离心10min；反复洗涤2次。弃去上清，加入1ml Trizol后，剧烈振荡，转移至1.5ml EP管中，
置-80℃冰箱保存。(具体方法参见：Wang Y,et al.MiR-548a-3p regulates inflammatory response via TLR4/NF-κB signaling pathway in rheumatoid arthritis.J Cell Biochem.2018.)
[0011]2、TRIzol法提取总RNA
[0012]将细胞浓度调为1×107/个加入1ml TRIzol试剂，用1ml移液器反复轻吹至液体澄清而且无细胞团块状态(置于冰上融化)；加200ul体积的氯仿颠倒混匀，置于冰上5min；4℃12000rmp离心15min；转移上层水相于另一新的1.5ml EP管中，加等体积(1：1)异丙醇，混匀，4℃，12000rmp离心10min，弃上清；然后加入预冷的75％乙醇1ml，4℃，7500rmp离心5min，弃上清；将提取物溶于10ul DEPC水中，立即保存于-80℃超低温冰箱中备用(具体方法参见：Xu D,et al.IL-29 Enhances LPS/TLR4-Mediated Inflammation in Rheumatoid Arthritis.Cell Physiol Biochem.2015；37:27-34.)。
[0013]3、RNA浓度和纯度的测定
[0014]用移液器取RNA样品1μl至缓冲液中，测定其在260nm和280nm处吸光值；根据吸光值及稀释倍数测定RNA的浓度，以保证后续实验顺利进行。
[0015]具体测定方法参见文献：“徐栋花.乳酸杆菌对LPS诱导THP-1细胞炎症性细胞因子释放的调节作用及可能机制[D].南京医科大学,2011.”。
[0016]4、cDNA合成及PCR反应
[0017]严格按照PrimeScript TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)说明书进行，步骤如下：
豫公网安备41160202000603
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