(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010424466.X
(22)申请日 2020.05.19
(71)申请人 中山大学肿瘤防治中心（中山大学
附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究
所）
地址 510060 广东省广州市越秀区东风东
路651号
(72)发明人 刘然义 彭绮华 岳欣
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有
限公司 44245
代理人 苏运贞 裘晖
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6886(2018.01)
G01N 33/574(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明属于生物医药技术领域，公开了
METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药
物敏感性的试剂盒中的应用。该应用是基于
本发明发明人发现，METTL2蛋白表达能增强结直
肠癌细胞对5-FU的敏感性，结直肠癌患者肿瘤组
织高表达METTL2与5-FU化疗的良好预后呈正相
关。从而，临床医生可以通过结直肠癌患者
METTL2基因的表达情况，确定结直肠癌患者是否
适用氟尿嘧啶类药物，制定个性化方
案。
权利要求书2页 说明书10页序列表6页 附图5页CN 111518909 A 2020.08.11
C N 111518909
A
1.METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的氟尿嘧啶类药物为5-FU和Capecitabine中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括检测METTL2 mRNA量的试剂和检测METTL2蛋白量的试剂中的一种或两种。
4.根据权利要求3所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的检测METTL2 mRNA量的试剂为能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂。
5.根据权利要求4所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂包括依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物。
6.根据权利要求5所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂还包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物。
7.根据权利要求5和6所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述的依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示的20对引物对中的任一对；核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示的引物名称中第一个数字相同为同一对引物；
所述的依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41～42所示的引物对。
8.根据权利要求3～7任一项所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂为组合试剂A和组合试剂B中的至少一种；其中，组合试剂A为依据探针法得到的组合试剂，包括但不限于：依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR 的探针、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针；所述的探针进一步为TaqMan探针；
组合试剂B为依据染料法得到的组合试剂，包括但不限于：依据METTL2 mRNA设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物和染料；所述的染料进一步为SYBR Green。
9.根据权利要求3所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的检测METTL2蛋白量的试剂为能进行WESTERN BLOT 的试剂和能进行免疫组化染的试剂中的至少一种。
10.根据权利要求9所述的METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用，其特征在于：
所述的能进行WESTERN BLOT的试剂包括但不限于：抗METTL2抗体、抗内参蛋白抗体、通
用二抗及显和发光试剂；
所述的能进行免疫组化染的试剂包括但不限于：抗METTL2抗体、通用二抗及显试剂。
METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性
的试剂盒中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物医药技术领域，特别涉及METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用。
背景技术
[0002]结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)在世界范围内的发病率和死亡率均居全球所有类型肿瘤的第三位。近几十年随着我国经济和科学技术发展，大幅度提高人们的生活水平同时伴随西式饮食模式的普及，结直肠癌的发病率逐年攀升。自20世纪50年代，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)作为结直肠癌的基本药物应用于临床以来，5-FU和Capecitabine(口服药)等氟尿嘧啶类药物(FU)至今仍是不同分期结直肠癌患者的一线化疗方案(例如，CAPEOX，FOLFOX，FOLFIRI，XELOX等)的重要组分。然而5-FU的单药有效率只有10-15％，联合亚叶酸钙(Leucovorin，LV)有效率可从11％提高到25％，但总体有效率仍然偏低，肿瘤对FU的敏感性成为制约患者化疗疗效及预后最重要的因素之一。因此我们亟需深入研究如何有效评估结直肠癌患者对FU的敏感性，以便提高药物有效性、控制FU耐药的产生。寻特异性调控FU代谢及敏感或耐药相关基因，以便临床医生根据不同结直肠癌患者制定更合理的个性化方案，对于优化医疗资源结构具有极为重要意义。
发明内容
[0003]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用。
[0004]本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
[0005]METTL2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物敏感性的试剂盒中的应用。是基于本发明发明人发现，METTL2能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性，结直肠癌患者肿瘤组织中高表达METTL2与5-FU化疗的良好预后呈正相关。从而，临床医生可以通过结直肠癌患者肿瘤组织中METTL2基因的表达情况，确定结直肠癌患者是否适用氟尿嘧啶类药物，制定个性化方案。
[0006]所述的氟尿嘧啶类药物优选为5-FU和Capecitabine中的至少一种；更优选为5-FU。
[0007]所述的试剂盒包括检测METTL2 mRNA量的试剂和检测METTL2蛋白量的试剂中的一种或两种。
[0008]所述的检测METTL2 mRNA量的试剂优选为能进行反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的试剂。
[0009]所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂包括依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物；优选为包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示的20对引物对中的任一对；核苷酸序列如SEQ ID NO.1～40所示的引物名称中第一个数字相同为同一
对引物。
[0010]所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂还包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物；优选为包括依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物；更优选为包括核苷酸序列如SEQ ID NO.41～42所示的引物对。[0011]所述的能进行反转录-实时荧光定量PCR的试剂优选为组合试剂A和组合试剂B中的至少一种；其中，组合试剂A为依据探针法得到的组合试剂，包括但不限于：依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据METTL2 mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的探针；
[0012]组合试剂B为依据染料法得到的组合试剂，包括但不限于：依据METTL2 mRNA设计的用于实时荧光定量PCR的引物、依据内参基因mRNA序列设计的用于实时荧光定量PCR的引物和染料。
[0013]所述的探针优选为Taqman探针。
[0014]所述的染料优选为SYBR Green。
[0015]所述的检测METTL2蛋白量的试剂优选为能进行WESTERN BLOT(WB)的试剂和能进行免疫组化染(IHC)的试剂。
[0016]所述的能进行WESTERN BLOT(WB)的试剂包括但不限于：抗METTL2抗体、抗内参蛋白抗体、通用二抗及显或发光试剂。
[0017]所述的内参蛋白优选为GAPDH。
[0018]所述的能进行免疫组化染(IHC)的试剂包括但不限于：抗METTL2抗体、通用二抗及显试剂。
[0019]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0020]本发明人发现METTL2不影响结直肠癌细胞的增殖能力，但通过体内外实验发现：METTL2在体外细胞水平和动物体内均能增强结直肠癌细胞对5-FU的敏感性。本发明基于人类全基因组RNAi技术筛选出结直肠癌的5-FU敏感基因METTL2，分析其表达与接受含氟尿嘧啶化疗的肠癌患者预后的相关性，为临床医生根据不同个体遗传差异制定更为合理的化疗方案提供参考证据，对于优化医疗资源结构具有极为重要意义。
附图说明
[0021]图1为全基因组RNAi技术筛选5-FU敏感相关基因流程图。
[0022]图2为稳定敲降不同候选基因后HCT116细胞株的5-FU量效曲线及5-FU耐药性变化结果图。
[0023]图3是Western blot(WB)和反转录-定量PCR(RT-qPCR)法检测HCT116细胞经5-FU 处理前后METTL2的表达情况图。
[0024]图4是WB和RT-qPCR法检测HCT-8及其耐药株HCT-8-FU中METTL2表达情况图。[0025]图5为METTL2对结直肠癌细胞增殖能力的影响结果图；其中，图A为CCK-8实验结果图；图B为平板克隆形成实验结果图。
[0026]图6为METTL2增强结直肠癌细胞的5-FU敏感性结果图；其中，图A为CCK8实验结果图；图B为平板克隆形成实验结果图。
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