(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010561062.5
(22)申请日 2020.06.18
(71)申请人 安徽国泰国瑞医疗科技有限公司
地址 238000 安徽省合肥市瑶海区大店工
业园黄莆山路2号2#厂房
(72)发明人 胡康 胡林立 张成军
(74)专利代理机构 合肥正则元起专利代理事务
所(普通合伙) 34160
代理人 韩立峰
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
C12R 1/93(2006.01)
(54)发明名称用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂及其制备方法(57)摘要本发明公开了一种用于COVID -19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂及其制备方法，该冻干PCR试剂根据COVID -19病毒、FluA病毒、FluB 病毒的特异性基因序列设计三种不同的上游引物、下游引物、TaqMan探针，使得冻干PCR试剂能够针对已经有发热症状的患者，同时检测COVID -19、FluA、FluB三种病原体，判断可致发热症状的病原体是否为COVID -19、FluA、FluB中的一种或多种，该试剂中含有尿嘧啶-DNA糖基化酶防污染体系，并以dUTP替代dTTP作为PCR原料，在进行PCR扩增时，尿嘧啶-DNA糖基化酶能消化PCR产物中含U的PCR产物，进而防止PCR产物气溶胶污染， 保证冻干剂型的PCR试剂检测效果。权利要求书2页 说明书6页 附图2页CN 111647688 A 2020.09.11
C N 111647688
A
1.用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：包括Taq DNA聚合酶1-20单位、逆转录酶20-200单位、尿嘧啶-DNA糖基化酶0.1-1单位、核糖核酸酶抑制剂1-40单位、上游引物1-20pmol、下游引物1-20pmol、TaqMan探针0.5-10pmol、dATP 2.5-100nmol、dCTP 2.5-100nmol、dGTP 2.5-100nmol、dUTP 2.5-100nmol、镁离子0.01-0.2μmol、Tris 0.25-2.5μmol、钾离子0.25-5μmol和m/v为2-15％冻干保护剂；
该冻干PCR试剂的制备步骤如下：
步骤S1：将上述试剂进行混合，混合均匀后，调节混合液pH值为8.3-8.9，制得PCR试剂；
步骤S2：将步骤S1制得的PCR试剂加入PCR管中，在不盖盖的条件下放入冻干机中，进行冻干反应后，在氮气环境下封装冻干PCR试剂；
步骤S3：将待测样品进行核酸提取，得到核酸溶液；
步骤S4：将步骤S2制得的冻干PCR试剂加入步骤S3制得的核酸溶液中，制得混合液；
步骤S5：将步骤S4制得的混合液进行PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：所述的Taq DNA聚合酶为5单位，逆转录酶为50单位，尿嘧啶-DNA糖基化酶为0.25单位，核糖核酸酶抑制剂为10单位，上游引物为5pmol，下游引物为5pmol，TaqMan探针为2.5pmol，dATP为5nmol，dCTP为5nmol，dGTP为5nmol，dUTP为10nmol，镁离子为0.05μmol，Tris为1.25μmol，钾离子为2.25μmol，冻干保护剂m/v为7.2％。
3.根据权利要求2所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：所述的逆转录酶为AMV逆转录酶和M-Mulv逆转录酶中的一种或两种任意比例混合，上游引物为COVID-19、FluA、FluB病毒和人GAPDH基因的上游引物，下游引物为COVID-19、FluA、FluB病毒和人GAPDH基因的下游引物，TaqMan探针为COVID-19、FluA、FluB病毒和人GAPDH基因的TaqMan探针，冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、岩藻糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖苷、聚乙二醇中的一种或多种任意比例的混合。
4.根据权利要求3所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：
所述的COVID-19病毒的上游引物序列如下：
5’-AGAATGGAGAACGCAGTGGG-3’，
COVID-19病毒的下游引物序列如下：
5’-TGAGAGCGGTGAACCAAGAC-3’，
COVID-19病毒的TaqMan探针序列如下：
5’-FAM-CGCGATCAAAACAACGTCGGCC-BHQ13’，
FluA病毒的上游引物序列如下：
5’-GTTGGTRATGAAACGRAAACGGG-3’，
FluA病毒的下游引物序列如下：
5’-CCGAATYCTTTTGGTCGCTGT-3’，
FluA病毒的TaqMan探针序列如下：
5’-VIC-CTCTAGCATACTTACTGACAGC-MGB-3’，
FluB病毒的上游引物序列如下：
5’-CACAAATGCAACCAGACCTGC-3’，
FluB病毒的下游引物序列如下：
5’-GGGGAGAGAAAATTCTCCTGCAT-3’，
FluB病毒的TaqMan探针序列如下：
5’-Cy5-TTAGACAGRATAGCTGCTGGCA-MGB-3’，
人GAPDH基因的上游引物序列如下：
5’-ACTTAGAGAAGGGGTGGGCT-3’，
人GAPDH基因的下游引物序列如下：
5’-ACGCTTGTACACTCAGCATCA-3’，
人GAPDH基因的TaqMan探针序列如下：
5’-ROX-ccctgtccagttaatttctgacctttactcctgC-BHQ2-3’，
上述探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
5.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：步骤S1所述的pH值为8.7，PCR试剂的终反应体积为25μL或50μL，当终反应体积为50ul 时，除冻干保护剂之外的其它组分用量加倍。
6.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：步骤S2所述的冻干反应程序为-45℃，2h；-45℃，20Pa，2h；-45℃，10Pa，16h；25℃，10Pa，2h。
7.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：步骤S4所述的冻干PCR试剂和核酸溶液用量比为25μL：1-25μL或50μL：1-50μL，当核酸溶液不足25μL时，用无RNase水补充至25μL，当核酸溶液不足50μL时，用无RNase水补充至50μL。
8.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，其特征在于：步骤S5所述的PCR扩增程序为：50℃，5-15min，94℃，5min；95℃，5秒钟，60℃，30秒钟，45个循环，FAM/HEX/ROX/CY5通道检测荧光。
9.根据权利要求1所述的用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
步骤S1：将上述试剂进行混合，混合均匀后，调节混合液pH值为8.3-8.9，制得PCR试剂；
步骤S2：将步骤S1制得的PCR试剂加入PCR管中，在不盖盖的条件下放入冻干机中，进行冻干反应后，在氮气环境下封装冻干PCR试剂；
步骤S3：将待测样品进行核酸提取，得到核酸溶液；
步骤S4：将步骤S2制得的冻干PCR试剂加入步骤S3制得的核酸溶液中，制得混合液；
步骤S5：将步骤S4制得的混合液进行PCR扩增。
用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂及其制备
方法
技术领域
[0001]本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于COVID-19、FluA、FluB 病毒检测的冻干PCR试剂及其制备方法。
背景技术
[0002]世界卫生组织将新型冠状病毒命名为COVID-19，COVID-19感染患者以发热、 咳嗽、疲乏、无力
为主要症状，该症状与甲型流感病毒(FluA)、乙型流感病 毒(FluB)感染症状具有类似之处，此外，与2003年爆发的SARS病毒(非典 型肺炎病毒)不同，COVID-19具有更强传染性，而且有可能与FluA类似，长期 存在并季节性爆发。
[0003]现有核酸检测产品中多以COVID-19单种病毒检测产品为主，可以以较低成 本对人进行大规模的COVID-19筛查，但无法检测出因为FluA和FluB病原体 造成的发热症状，使得试剂盒的适用范围降低；现有核酸检测产品基本为液体 剂型，液体剂型试剂在运输过程中需要进行冷链运输，冷链运输使得试剂在运 输过程的成本提升，且在储存过程中需冷藏大大提升了储存成本，并在储运过 程中试剂失效的风险较高；现有核酸检测产品在检测PCR产物时，易被PCR产 物气溶胶污染。
发明内容
[0004]本发明的目的在于提供一种用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR 试剂及其制备方法。
[0005]本发明要解决的技术问题：
[0006]现有核酸检测产品中多以COVID-19单种病毒检测产品为主，可以以较低成 本对人进行大规模的COVID-19筛查，但无法检测出因为FluA和FluB病原体 造成的发热症状，使得试剂盒的适用范围降低；
[0007]现有核酸检测产品基本为液体剂型，液体剂型试剂在运输过程中需要进行 冷链运输，冷链运输使得试剂在运输过程的成本提升，且在储存过程中需冷藏 大大提升了储存成本，并在储运过程中试剂失效的风险较高；
[0008]现有核酸检测产品在检测PCR产物时，易被PCR产物气溶胶污染。
[0009]本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0010]用于COVID-19、FluA、FluB病毒检测的冻干PCR试剂，包括TaqDNA聚合 酶1-20单位、逆转录酶20-200单位、尿嘧啶-DNA糖基化酶0.1-1单位、核糖 核酸酶抑制剂1-40单位、上游引物1-20pmol、下游引物1-20pmol、TaqMan探 针0.5-10pmol、dATP2.5-100nmol、dCTP2.5-100nmol、dGTP2.5-100nmol、 dUTP2.5-100nmol、镁离子0.01-0.2μmol、Tris0.25-2.5μmol、钾离子0.25-5 μmol、冻干保护剂2-15％(m/v)；
[0011]该冻干PCR试剂的制备步骤如下：
[0012]步骤S1：将上述试剂进行混合，混合均匀后，调节混合液pH值为8.3-8.9， 制得PCR
试剂；
[0013]步骤S2：将步骤S1制得的PCR试剂加入PCR管中，在不盖盖的条件下放入 冻干机中，进行冻干反应后，在氮气环境下封装冻干PCR试剂；
[0014]步骤S3：将待测样品进行核酸提取，得到核酸溶液；
[0015]步骤S4：将步骤S2制得的冻干PCR试剂加入步骤S3制得的核酸溶液中， 制得混合液；
[0016]步骤S5：将步骤S4制得的混合液进行PCR扩增。
[0017]进一步，所述的TaqDNA聚合酶为5单位，逆转录酶为50单位，尿嘧啶-DNA 糖基化酶为0.25单位，核糖核酸酶抑制剂为10单位，上游引物为5pmol，下游 引物为5pmol，TaqMan探针为2.5pmol，dATP为5nmol，dCTP为5nmol，dGTP 为5nmol，dUTP为10nmol，镁离子为0.05μmol，Tris为1.25μmol，钾离子 为2.25μmol，冻干保护剂为7.2％。
[0018]进一步，所述的逆转录酶为AMV逆转录酶和M-Mulv逆转录酶中的一种或两 种任意比例混合，上游引物为COVID-19、FluA、FluB病毒和人GAPDH基因的上 游引物，下游引物为COVID-19、FluA、FluB病毒和人GAPDH基因的下游引物， TaqMan探针为COVID-19、FluA、FluB 病毒和人GAPDH基因的TaqMan探针，冻 干保护剂为海藻糖、蔗糖、葡萄糖、岩藻糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖苷、聚 乙二醇中的一种或多种任意比例的混合。
[0019]进一步，所述的COVID-19病毒的上游引物序列如下：
[0020]5’-AGAATGGAGAACGCAGTGGG-3’，
[0021]COVID-19病毒的下游引物序列如下：
[0022]5’-TGAGAGCGGTGAACCAAGAC-3’，
[0023]COVID-19病毒的TaqMan探针序列如下：
[0024]5’-FAM-CGCGATCAAAACAACGTCGGCC-BHQ13’，
[0025]FluA病毒的上游引物序列如下：
[0026]5’-GTTGGTRATGAAACGRAAACGGG-3’，
[0027]FluA病毒的下游引物序列如下：
[0028]5’-CCGAATYCTTTTGGTCGCTGT-3’，
[0029]FluA病毒的TaqMan探针序列如下：
[0030]5’-VIC-CTCTAGCATACTTACTGACAGC-MGB-3’，
[0031]FluB病毒的上游引物序列如下：
[0032]5’-CACAAATGCAACCAGACCTGC-3’，
[0033]FluB病毒的下游引物序列如下：
[0034]5’-GGGGAGAGAAAATTCTCCTGCAT-3’，
[0035]FluB病毒的TaqMan探针序列如下：
[0036]5’-Cy5-TTAGACAGRATAGCTGCTGGCA-MGB-3’，
[0037]人GAPDH基因的上游引物序列如下：
[0038]5’-ACTTAGAGAAGGGGTGGGCT-3’，
[0039]人GAPDH基因的下游引物序列如下：
[0040]5’-ACGCTTGTACACTCAGCATCA-3’，
[0041]人GAPDH基因的TaqMan探针序列如下：
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