(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911113651.0
(22)申请日 2019.11.14
(71)申请人 昆明医科大学第一附属医院
地址 650034 云南省昆明市西昌路295号
(72)发明人 徐丹 起珏 颜光前 张娟 涂颖
唐杰 孙东杰
(74)专利代理机构 北京和信华成知识产权代理
事务所(普通合伙) 11390
代理人 张永辉
(51)Int.Cl.
C12Q 1/02(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法(57)摘要本发明公开了一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，所述方法包括以下步骤：细胞培养，从活的机体中取出组织，分散成单个细胞，并将细胞放置于DMEM高糖型培养基中，放入培养箱中进行常规培养，细胞24小时左右贴壁，长满后用0.25 ％胰蛋白酶消化液消化、传代，接种5*104/ml细胞于48孔板用于进一步实验；将48孔板上放置在超净台上，48孔板上的上端滑动盖有小盖片，超净台里面设置紫外灯，紫外灯先预热15min。本发明通过光学显微镜下观察细胞的形态学改变，通过MTT法检测细胞的增殖活性，通过荧光试剂盒法检测细胞的活性氧水平，结果随紫外线照射时间的增加，在光镜下可见细胞不同程度的损伤，其增殖活性大大降低，活性氧水平大大提高，
进而诱导细胞凋亡。权利要求书1页 说明书4页CN 110791544 A 2020.02.14
C N 110791544
A
1.一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：S1：细胞培养，从活的机体中取出组织，分散成单个细胞，并将细胞放置于DMEM高糖型培养基中，放入培养箱中进行常规培养，细胞24小时左右贴壁，长满后用0.25％胰蛋白酶消化液消化、传代，接种5*104/ml细胞于48孔板用于进一步实验；
S2：将48孔板上放置在超净台上，48孔板上的上端滑动盖有小盖片，超净台里面设置紫外灯，紫外灯先预热15min，将已经接种的孔板置于紫外灯下，通过紫外灯对48孔板内的细胞进行照射，通过小盖板将4
8孔板左侧的40孔遮盖住，最右侧的第一组八孔暴露在紫外灯下进行照射，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第二组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第三组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第四组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第五组八孔，5分钟后，结束照射，最左侧的第六组八孔不进行照射，为对照组；
S3：紫外照射结束后，继续将48孔板置于培养箱中培养24h，24h后在光学显微镜下观察细胞的形态学改变；
S4：通过MTT比法对六组细胞进行细胞活率的测定；
S5：通过荧光试剂盒法对六组细胞进行活性氧水平的测定。
2.根据权利要求1所述的一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述S1和S3中培养箱内细胞的生存环境均设置为37摄氏度、5％CO 2和pH7.2-7.4。
3.根据权利要求1所述的一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述S2中紫外灯发出的紫外线设置为UVB波段，且紫外灯距离48孔板的垂直距离为30cm。
4.根据权利要求1所述的一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述S2中紫外灯发出的紫外线照射强度通过辐照计测得为0.355W/m 2。
5.根据权利要求1所述的一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述S4中MTT比法测定细胞活率的具体方法为：
a、分别将各组细胞按分组加入24孔板内，每组4孔；
b、每孔加200ul培养液，37摄氏度、5％CO 2、饱和湿度下进行培养；
c、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养液180ul、再加MTT溶液20ul，继续培养；
d、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO溶液150ul，振荡5分钟；
e、酶标仪492nm波长处比，得出各组细胞活率。
6.根据权利要求1所述的一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，其特征在于：所述S5中荧光试剂盒检测活性氧水平的具体方法为：收集各组经照射后的细胞，用荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸脂孵育细胞30min，弃上清，PBS将细胞润洗3次，细胞内荧光强度用荧光分光光度计测定，激发波长488nm，发射波长525nm，另设空白对照组即不装载探针的细胞，检测细胞内活性氧的水平。
权 利 要 求 书1/1页CN 110791544 A
一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法
技术领域
[0001]本发明涉及细胞实验技术领域，具体为一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法。
背景技术
[0002]紫外线是一种低能量的电磁辐射，具有多种生物学效应，如杀菌、致炎症、致癌等作用，职业性和生活性接触一定量的紫外辐射可导致人体神经内分泌系统失调，免疫功能下降等，日光中紫外线对皮肤的损伤作用越来越受到人们的重视，这是由于随着大气污染的日益严重，臭氧层逐渐变薄，使人们接触日光中紫外线辐射的机会越来越多，皮肤暴露于紫外线可出现素沉着、斑形成、皮肤老化、皮肤癌等，在太阳辐射中能到达地球表面的紫外线分为长波紫外线UVA和中波紫外线UVB，虽然UVB相对于UVA只占很小的比例，但由于UVB和暴露的太阳光线比较贴近，而且此波段的紫外线生物学效应最强，UVB可以通过直接损伤DNA或诱发氧化反应产生自由基等机制作用于机体细胞，引起突变频率增加、细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡的发生、促进细胞增殖甚至引起皮肤癌，为了了解紫外线所致皮肤疾病的机制和为防治紫外线损伤提供一定的理论依据，因此有必要对紫外线照射细胞造成的损伤进行实验。
发明内容
[0003](一)解决的技术问题
[0004]本发明的目的在于提供一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，以便于了解紫外线所致皮肤疾病的机制和为防治紫外线损伤提供一定的理论依据。
[0005](二)技术方案
[0006]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]S1：细胞培养，从活的机体中取出组织，分散成单个细胞，并将细胞放置于DMEM高糖型培养基中，放入培养箱中进行常规培养，细胞24小时左右贴壁，长满后用0.25％胰蛋白酶消化液消化、传代，接种5*104/ml细胞于48孔板用于进一步实验；
[0008]S2：将48孔板上放置在超净台上，48孔板上的上端滑动盖有小盖片，超净台里面设置紫外灯，紫外灯先预热15min，将已经接种的孔板置于紫外灯下，通过紫外灯对48孔板内的细胞进行照射，通过小盖板将48孔板左侧的40孔遮盖住，最右侧的第一组八孔暴露在紫外灯下进行照射，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第二组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第三组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第四组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第五组八孔，5分钟后，结束照射，最左侧的第六组八孔不进行照射，为对照组；
[0009]S3：紫外照射结束后，继续将48孔板置于培养箱中培养24h，24h后在光学显微镜下观察细胞的形态学改变；
[0010]S4：通过MTT比法对六组细胞进行细胞活率的测定；
[0011]S5：通过荧光试剂盒法对六组细胞进行活性氧水平的测定。
[0012]优选的，所述S1和S3中培养箱内细胞的生存环境均设置为37摄氏度、5％CO2和pH7.2-7.4。
[0013]优选的，所述S2中紫外灯发出的紫外线设置为UVB波段，且紫外灯距离48孔板的垂直距离为30cm。
[0014]优选的，所述S2中紫外灯发出的紫外线照射强度通过辐照计测得为0.355W/m2。[0015]优选的，所述S4中MTT比法测定细胞活率的具体方法为：
[0016]a、分别将各组细胞按分组加入24孔板内，每组4孔；
[0017]b、每孔加200ul培养液，37摄氏度、5％CO2、饱和湿度下进行培养；
[0018]c、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养液180ul、再加MTT溶液20ul，继续培养；
[0019]d、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO溶液150ul，振荡5分钟；
[0020]e、酶标仪492nm波长处比，得出各组细胞活率。
[0021]优选的，所述S5中荧光试剂盒检测活性氧水平的具体方法为：收集各组经照射后的细胞，用荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸脂孵育细胞30min，弃上清，PBS将细胞润洗3次，细胞内荧光强度用荧光分光光度计测定，激发波长488nm，发射波长525nm，另设空白对照组即不装载探针的细胞，检测细胞内活性氧的水平。
[0022](三)有益效果
[0023]与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0024]本发明通过设置小盖片，使得六组实验均在同一个48孔板内，经同一个紫外光源进行照射，在同一个培养箱内进行培养，故实验条件更加接近，实验变量更少，实验结果更准确，且简化实验步骤，提高实验效率，随紫外线照射时间的增加，在光镜下可见细胞不同程度的损伤，其增殖活性大大降低，活性氧水平大大提高，进而诱导细胞凋亡。
具体实施方式
[0025]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]本发明提供的一种实施例：一种基于紫外线照射的细胞损伤实验方法，方法包括以下步骤：
[0027]S1：细胞培养，从活的机体中取出组织，分散成单个细胞，并将细胞放置于DMEM高糖型培养基中，放入培养箱中进行常规培养，细胞24小时左右贴壁，长满后用0.25％胰蛋白酶消化液消化、传代，接种5*104/ml细胞于48孔板用于进一步实验；
[0028]S2：将48孔板上放置在超净台上，48孔板上的上端滑动盖有小盖片，超净台里面设置紫外灯，紫外灯先预热15min，将已经接种的孔板置于紫外灯下，通过紫外灯对48孔板内的细胞进行照射，通过小盖板将48孔板左侧的40孔遮盖住，最右侧的第一组八孔暴露在紫外灯下进行照射，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第二组八孔，5分钟后，将小盖片
向左移动，继续暴露出第三组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第四组八孔，5分钟后，将小盖片向左移动，继续暴露出第五组八孔，5分钟后，结束照射，最左侧的第六组八孔不进行照射，为对照组；
[0029]S3：紫外照射结束后，继续将48孔板置于培养箱中培养24h，24h后在光学显微镜下观察细胞的形态学改变；
[0030]S4：通过MTT比法对六组细胞进行细胞活率的测定；
[0031]S5：通过荧光试剂盒法对六组细胞进行活性氧水平的测定。
[0032]进一步，S1和S3中培养箱内细胞的生存环境均设置为37摄氏度、5％CO2和pH7.2-7.4。
[0033]进一步，S2中紫外灯发出的紫外线设置为UVB波段，且紫外灯距离48孔板的垂直距离为30cm。
[0034]进一步，S2中紫外灯发出的紫外线照射强度通过辐照计测得为0.355W/m2。[0035]进一步，S4中MTT比法测定细胞活率的具体方法为：
[0036]a、分别将各组细胞按分组加入24孔板内，每组4孔；
[0037]b、每孔加200ul培养液，37摄氏度、5％CO2、饱和湿度下进行培养；
[0038]c、测定前2h，每孔吸弃原培养液，加高糖培养液180ul、再加MTT溶液20ul，继续培养；
[0039]d、到2h测定时，每孔吸弃培养液，加DMSO溶液150ul，振荡5分钟；
[0040]e、酶标仪492nm波长处比，得出各组细胞活率。
[0041]进一步，S5中荧光试剂盒检测活性氧水平的具体方法为：收集各组经照射后的细胞，用荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸脂孵育细胞30min，弃上清，PBS将细胞润洗3次，细胞内荧光强度用荧光分光光度计测定，激发波长488nm，发射波长525nm，另设空白对照组即不装载探针的细胞，检测细胞内活性氧的水平。
[0042]细胞经照射后，在光学显微镜下观察细胞的形态时，细胞皱缩，变成圆形，核浓缩，且随着照射时间的增加，细胞皱缩程度逐渐加重，细胞漂浮的现象越明显；
[0043]通过MTT比法对六组细胞进行细胞活率的测定数据和通过荧光试剂盒法对六组细胞进行活性氧水平的测定数据如下表所示，可见紫外线对细胞活率和活性氧水平均有明显的影响，随之照射时间的增加，细胞活率逐渐降低，活性氧水平逐渐升高，活性氧自由基对细胞的凋亡起着至关重要的作用，较高的活性氧自由基使得细胞内活动过于频繁，使得碱基配对错误，单、双链断裂，容易导致细胞死亡。
[0044]
[0045]工作原理：本发明通过细胞培养、紫外照射以及细胞检测等步骤对紫外线对细胞的影响进行实验，实验样本分层六组，第一组到第五组为实验组，分别照射5min、10min、15min、20min、和25min，第六组为对照组，不进行照射，且第一组到第六组均设置在同一个
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