(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010973070.0
(22)申请日 2020.09.16
(71)申请人 复旦大学
地址 200433 上海市杨浦区邯郸路220号
(72)发明人 李富友 王瑞 徐明
(74)专利代理机构 上海科盛知识产权代理有限
公司 31225
代理人 褚明伟
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/6844(2018.01)
C12R 1/93(2006.01)
(54)发明名称
基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA
(57)摘要
本发明涉及基于RT ‑RPA和CRISPR的可视化
新冠病毒RNA核酸检测试剂盒。包括反转录重组
聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系在反应前物
理分隔成溶液不连通的两部分；所述检测试剂盒
使用时，RT ‑RPA扩增完成后，反转录重组聚合酶
扩增体系和CRISPR切割体系混匀，混匀体系中的
各试剂浓度称为工作浓度。与现有技术相比，本
发明的检测试剂盒可以将整个反应在同一管中
进行，只在加样时开盖一次，大大简化了操作并
且避免了扩增子干扰的风险，检测灵敏度可达单
分子水平，并且只需要一个简单的热块和便携蓝
光灯即可实现检测，适用于对新冠病毒的现场快
速高灵敏筛查。权利要求书2页 说明书6页 附图3页CN 112239795 A 2021.01.19
C N 112239795
A
1.一种基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，包括反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系，反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系在反应前物理分隔成溶液不连通的两部分；所述检测试剂盒使用时，RT-RPA扩增完成后，反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系混匀，混匀体系中的各试剂浓度称为工作浓度。
2.根据权利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，反转录重组聚合酶扩增体系的体积不小于混匀后总反应体积的4/5，CRISPR切割体系的体积不大于混匀后总反应体积的1/5。
3.根据权利要求2所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，对于25uL总反应体积，反转录重组聚合酶扩增体系的体积为20-25uL，CRISPR切割体系的体积不大于5uL。
4.根据权利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，反转录重组聚合酶扩增体系中含有RPA酶冻干粉，rehydration RPA buffer，NEB buffer 2.1，反转录酶，RNase inhibitor，醋酸镁，引物，模板；
CRISPR切割体系中含有Cas12a酶，向导RNA，单链DNA荧光猝灭探针。
5.根据权利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系混匀后的混匀体系体积为25uL 时，
(1)RPA酶冻干粉和rehydration RPA buffer的工作浓度均为1x；
(2)反转录酶的添加量为0.5uL-1uL；
(3)NEB buffer 2.1的添加量为2uL；
(4)醋酸镁将总反应体系中的镁离子工作浓度补足至10-14mM；
(5)RNase inhibitor的添加量为4-10unit；
(6)引物的工作浓度为0.1-0.5uM；
(7)Cas12a酶的工作浓度为0.1-0.5uM；
(8)向导RNA的工作浓度为Cas12a酶工作浓度的1-10倍，向导RNA的工作浓度为0.1-5uM；
(9)单链DNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.2uM-1uM。
6.根据权利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，RT-RPA引物序列为：
SARS-CoV-2F:ATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGG；
SARS-CoV-2R:GAAGGACATAAGATGATAGCCCTTTCCACAAAAA。
7.根据权利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，向导RNA序列为：GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU。
8.根据权利要求4所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，单链DNA荧光猝灭探针序列为：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ。
9.根据权利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系物理分隔的方式为：将反转录重组聚合酶扩增体系置于管底部，CRISPR切割体系置于管盖内。
10.根据权利要求1所述基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒，其特征在于，反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR切割体系物理分隔的方式为：将反转录重组聚合酶扩增体系和CRISPR体系分别置于两个相连的管中。
基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于核酸检测领域，尤其是涉及一种基于RT-RPA和CRISPR的可视化 新冠病毒RNA核酸检测试剂盒。
背景技术
[0002]新冠病毒可以通过人传人传播，并且有14天左右的潜伏期，因此对新冠病毒 的快速、高灵敏筛查非常必要。
[0003]现有的新冠病毒检测“金标准”主要是基于反转录PCR的检测方法。但是该 方法仪器复杂，成本高，非便携，不适用于对新冠病毒的现场快速检测。新兴的恒 温扩增方法如重组聚合酶扩增(RPA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉引物恒温 扩增(CPA)可在单一温度下进行，大大降低了对仪器的要求，但是其检测灵敏度 有待提高。
[0004]基于CRISPR的检测方法通过扩增子被向导RNA识别激活Cas12a酶，利用 Cas12a酶的旁系切割活性切割探针实现对检测信号的二次放大，检测灵敏度可达 到单分子水平。快速PCR和CRISPR结合的核酸检测方法被开发(Ultrafast visual nucleic acid detection with CRISPR/Cas12a and rapid PCR in sin
gle capillary，doi： / 10.1016/j.snb.2020.128618)。但是现有的基于CRISPR的检测方法操 作复杂，并且两步法容易造成扩增子气溶胶污染，并且有较高的背景信号干扰。
[0005]因此开发操作简便、灵敏度高的核酸检测方法对新冠病毒的核酸现场检测有 着非常重要的作用。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种新型的基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒 RNA 核酸检测试剂盒。
[0007]本发明的试剂盒基于反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)和CRISPR一体化反 应，能够实现对新冠病毒RNA的逆转录恒温扩增和CRISPR的一体化、可视化检 测。
[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0009]本发明提供一种基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检测试 剂盒，包括两个部分：反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)体系和CRISPR切割体 系，两者在反应前物理分隔成溶液不连通的两部分。
[0010]在RT-RPA扩增完成后将反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)体系和CRISPR 切割体系混匀，混匀体系中的各试剂浓度称为工作浓度。
[0011]进一步地，反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)体系的体积尽可能不小于混匀 后总反应体积的4/5，CRISPR切割体系的体积尽可能不大于混匀后总反应体积的 1/5。[0012]进一步地，以25uL总反应体积为例，RT-RPA体系的体积为20-25uL，CRISPR 切割体系的体积不大于5uL。
[0013]进一步地，RT-RPA体系中含有RPA酶冻干粉，rehydration RPA buffer，NEB
buffer 2.1，反转录酶，RNase inhibitor，醋酸镁，引物，模板。
[0014]进一步地，CRISPR切割体系中含有Cas12a酶，向导RNA(crRNA)，单链 DNA荧光猝灭探针(ssDNA荧光猝灭探针)。
[0015]进一步地，以反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)体系和CRISPR切割体系混 匀后的混匀体系体积为25uL时，
[0016](1)RPA酶冻干粉和rehydration RPA buffer均来自于Twist商业化试剂盒， 两者的工作浓度均为1x。
[0017](2)反转录酶的添加量为0.5uL-1uL。
[0018](3)NEB buffer 2.1的添加量为2uL。
[0019](4)醋酸镁将总反应体系中的镁离子工作浓度补足至10-14mM。
[0020](5)RNase inhibitor的添加量为4-10unit。
[0021](6)引物的工作浓度为0.1-0.5uM。
[0022](7)Cas12a酶的工作浓度为0.1-0.5uM。
[0023](8)crRNA的工作浓度为Cas12a酶工作浓度的1-10倍，crRNA的工作浓度 为0.1-5uM。
[0024](9)ssDNA荧光猝灭探针的工作浓度为0.2uM-1uM。
[0025]进一步地，RT-RPA引物序列为：
[0026]SARS-CoV-2F:ATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGG
[0027]SARS-CoV-2R:GAAGGACATAAGATGATAGCCCTTTCCACAAAAA
[0028]crRNA序列为： GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU；
[0029]ssDNA荧光猝灭探针序列为：5’6-FAM-TTATT-3’BHQ。
[0030]反转录重组聚合酶扩增(RT-RPA)体系和CRISPR切割体系物理分隔的方式 包括但不限于将RT-RPA体系置于管底部，CRISPR切割体系置于管盖内；或者将 RT-RPA体系和CRISPR体系分别置于两个相连的管中。
[0031]优选地，将RT-RPA体系置于管底部，CRISPR切割体系置于管盖内，这样检 测试剂盒整个反应可以在同一管中进行，只在加样时开盖一次，大大简化了操作并 且避免了扩增子干扰的风险，检测灵敏度可达单分子水平，并且只需要一个简单的 热块和便携蓝光灯即可实现检测，适用于对新冠病毒的现场快速高灵敏筛查。
[0032]此外，本发明还提供基于RT-RPA和CRISPR的可视化新冠病毒RNA核酸检 测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0033](1)配置RT-RPA体系：RPA酶冻干粉和rehydration RPA buffer均来自于Twist 商业化试剂盒且工作浓度均配置为1x，反转录酶的添加量为0.5uL-2uL，NEB buffer 2.1的添加量为2uL，醋酸镁将总反应体系中的镁离子工作浓度补足至10-14mM， RNase inhibitor 的添加量为4-10unit，引物的工作浓度为0.36-0.4uM；
[0034](2)配置CRISPR切割体系：Cas12a酶的工作浓度为0.1-0.5uM，crRNA的 工作浓度为Cas12a酶工作浓度的1-10倍，crRNA的工作浓度为0.1-5uM，ssDNA 荧光猝灭探针的工作浓度为0.2uM-1uM；
[0035](3)将样品加入，RT-RPA扩增的反应条件为37℃反应10-30min，然后通过 甩动或离心将CRISPR体系与RT-RPA体系混匀，置于37℃继续反应10-30min；
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