(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911272879.4
(22)申请日 2019.12.12
(71)申请人 深圳先进技术研究院
地址 518055 广东省深圳市南山区西丽大
学城学苑大道1068号
(72)发明人 郑海荣 盛宗海 耿晓瑞 高笃阳
胡德红
(74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所
11430
代理人 范盈
(51)Int.Cl.
A61K 49/00(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明涉及一种用于近红外二区荧光检测
的吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途，具体公
以及嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿，其通过
1)将制备脂质双分子层的材料与吲哚菁绿混合
形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿
脂质体。本发明的脂质体制备方法简单，近红外
二区荧光强度高，
稳定性好。权利要求书1页 说明书9页 附图4页CN 110960694 A 2020.04.07
C N 110960694
A
1.一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体，其具有磷脂双分子层以及嵌在磷脂双分子层之间的吲哚菁绿，所述的吲哚菁绿脂质体外侧还可附有细胞膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的吲哚菁绿脂质体，磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1，更优选为100-500:1。
3.根据权利要求1所述的吲哚菁绿脂质体，所述的磷脂双分子层由磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物构成；优选地，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的组合；
更优选地，磷脂双分子层由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和胆固醇构成。
4.根据权利要求2-3任一项所述的吲哚菁绿脂质体，吲哚菁绿脂质体与细胞膜蛋白的质量比为200-400:1，
优选，所述的细胞膜蛋白选自癌细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、中性粒细胞膜蛋白、凝血调节蛋白、以二聚体或四聚体的形式存在的葡萄糖转运蛋白1、Neurothelin/HT7、血清γ谷氨酰转肽酶、P -糖蛋白、PD -
1配体PDL1/PDL2、Fas配体FasL、免疫共刺激蛋白B7-H4、膜相关补体调控蛋白CRRY以及非经典MHC I类分子。
5.权利要求1-4任一项所述的吲哚菁绿脂质体的制备方法，以薄膜分散法制备，其包括如下步骤：
1)将制备磷脂双分子层的材料与溶于有机溶剂的吲哚菁绿混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体；
任选地，吲哚菁绿脂质体的制备方法还包括步骤3)在吲哚菁绿脂质体的表面附着细胞膜蛋白。
6.根据权利要求5所述的制备方法，机械力分散指通过超声分散、脂质体挤出器反复挤出的方式进行分散。
7.根据权利要求5所述的制备方法，磷脂双分子层的材料选自磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物；
优选地，磷脂双分子层的材料与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1，更优选为100-500:1。
8.根据权利要求5所述的制备方法，步骤3)的方法为将膜蛋白与脂质体分散均匀，然后以脂质体挤出器进行挤出，分离具细胞膜蛋白的脂质体；优选地，分离具细胞膜蛋白的脂质体的方法为透析或离心。
9.权利要求1-4任一项所述的吲哚菁绿脂质体在制备近红外二区荧光检测试剂中的用途。
10.一种近红外二区用检测试剂，其包括权利要求1-4任一项所述的吲哚菁绿脂质体。
权 利 要 求 书1/1页CN 110960694 A
一种用于近红外二区荧光检测的吲哚菁绿脂质体及其制备方
法和用途
技术领域
[0001]本发明属于药物制剂领域，具体公开了一种吲哚菁绿脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
[0002]当前，肿瘤的致死率是仅次于心脑血管疾病的全球第二大致死疾病，严重威胁人类的健康。我国常见癌症种类发病约为137-174人/10万人，但死亡率超过117人/10万人，绝大多数肿瘤患者就诊时已达中晚期，肿瘤切除率仅为10％～30％。相关研究报道肿瘤的尺寸大小和诊断时的临床分期与肿瘤患者生存率密切相关。若在肿瘤早期进行诊断将会极大降低肿瘤病死率。
[0003]近红外(NIR)荧光成像是一种新兴的非侵入性生物医学成像模式，与其他几种成像模式，包括磁共振成像(MRI)、X射线、计算机断层扫描(CT)、正电子发射断层扫描(PET)、超声波检查(US)等相比，具有敏感性高、成本低、高时空分辨的优点，在肿瘤诊疗中具有极大的应用潜力。近红外二区(NIR-II，1 000～1 700nm)波长范围内组织和血液对光的吸收和散射显著降低，并且几乎无生物体自发荧光干扰，使得近红外二区荧光探针具有更深的组织穿透力和空间分辨率。目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。但多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。因此开发新型的近红外二区荧光的分子探针尤为重要。
[0004]吲哚菁绿(ICG)是目前被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的近红外荧光造影剂。有研究表明ICG在NIR-II窗口有荧光发射，具有近红外二区荧光成像的应用潜力。然而，ICG在水溶液中很不稳定、在血液循环中容易被快速清除，分子间容易形成二聚体导致荧光淬灭。这些不足严重限制了ICG在近红外二区诊疗方面的应用。
[0005]近年来，受到天然细胞的启发，人们尝试模仿天然细胞，构建仿生微纳米药物运输载体。其中，脂质体(Liposome)主要由胆固醇和天然磷脂组成，进入体内可被生物降解，不会在体内蓄积，无毒性、无致热原性、无免疫原性。脂质体被证明是一种行之有效的药物运输载体，它具有靶向性和淋巴定向性；
缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，延长作用时间；降低药物毒性；提高稳定性等优点。现已经有十几种脂质体药物载体被应用于临床医疗。虽然构成脂质体非常接近天然的细胞膜，但仍然无法完全躲避免疫清除。利用天然细胞膜伪装微纳米载体，获得的仿生微纳米载体不但具有微纳米载体自身的理化性能，而且具有类天然细胞的生物性能。细胞膜伪装的微纳米载体的研究尚处于起步阶段，开发更多的新型细胞膜伪装载体对于生物医学领域具有重要的意义。
[0006]目前，荧光增强的仿生吲哚菁绿脂质在近红外二区荧光成像的应用还未见有公开报道。本发明利用吲哚菁绿与磷脂小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入磷脂双分
子壳层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供新理论和新思路。
[0007]目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。但多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。因此开发新型的近红外二区荧光的分子探针尤为重要。为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明采用被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于临床的近红外荧光造影剂吲哚菁绿，利用它与磷脂
小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入脂质体壳层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。该化合物具有生物相容性好的特点，修饰不同的细胞膜可使这种高亮度的近红外二区荧光探针得到广泛应用。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供新理论和新思路。
发明内容
[0008]目前荧光发射光谱在近红外二区的材料主要有无机材料(纳米管、量子点、稀土纳米粒子)和有机材料(聚合物、有机小分子染料)。无机材料具有一定的毒性且代谢较为缓慢，多数NIR-II有机小分子荧光团存在水溶性差、光稳定性低、量子产率低等缺点。考虑到NIR-II成像剂的临床转化，具有低毒性，快速代谢性质的有机小分子荧光探针是最理想的选择。
[0009]本发明公开了一种高亮度的近红外二区吲哚菁绿仿生脂质体的合成方法，该方法利用吲哚菁绿与脂质小分子的疏水相互作用，合成吲哚菁绿被嵌入脂质双分子层的脂质体，吲哚菁绿避免了与水相互作用导致的自淬灭，近红外二区荧光强度显著提高。将细胞膜通过物理挤压修饰在纳米颗粒上形成仿生脂质体，具有类天然细胞的生物性能。该化合物具有生物相容性好的特点，修饰不同的细胞膜可使这种高亮度的近红外二区荧光探针得到广泛应用。本发明有助于推动近红外二区荧光成像的发展，为癌症的临床诊断提供理论和思路。
[0010]本发明一个方面提供了一种吲哚菁绿脂质体，其具有脂质双分子层以及嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿。
[0011]在本发明的技术方案中，嵌在脂质双分子层之间的吲哚菁绿是通过将吲哚菁绿和脂质双分子层的材料在有机相混合均匀分散成薄膜后，加入水相水化形成脂质体而形成的。
[0012]在本发明的技术方案中，所述的吲哚菁绿脂质体脂质双分子层还嵌入有细胞膜蛋白。
[0013]在本发明的技术方案中，所述的磷脂双分子层由磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物构成。
[0014]在本发明的技术方案中，所述磷脂选自二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰
胆碱、二油酰基卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或几种的组合。
[0015]在本发明的技术方案中，磷脂双分子层由二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二油酰基卵磷脂和胆固醇构成，优选地，其摩尔比例为二棕榈酰磷脂酰胆：二硬脂酰基磷脂酰胆碱：二油酰基
卵磷脂：胆固醇＝5:3:1:1。
[0016]在本发明的技术方案中，磷脂双分子层与吲哚菁绿的摩尔量比为25-1000:1，优选地为100-500:1，更优选为200-300:1。
[0017]本发明另一个方面提供了吲哚菁绿脂质体的制备方法，其包括如下步骤：[0018]1)将制备磷脂双分子层的材料与吲哚菁绿在有机相混合形成均匀溶液，去除有机溶剂获得分散的薄膜；
[0019]2)加入水相进行水化，机械力分散形成吲哚菁绿脂质体。
[0020]在本发明的技术方案中，吲哚菁绿脂质体的制备方法还包括步骤3)在吲哚菁绿脂质体的表面镶嵌细胞膜蛋白。
[0021]在本发明的技术方案中，机械力分散指通过超声分散、脂质体挤出器反复挤出的方式进行分散。
[0022]在本发明的技术方案中，步骤1)中去除溶剂的方法选自，以减压方式去除溶剂或在常压下气体吹拂的方式去除。
[0023]在本发明的技术方案中，制备过程中以惰性气体进行保护。
[0024]在本发明的技术方案中，吲哚菁绿脂质体与细胞膜蛋白的质量比为200-400:1，优选为250-300:1。
[0025]在本发明的技术方案中，磷脂双分子层的材料选自磷脂，或者磷脂和胆固醇的混合物。
[0026]在本发明的技术方案中，所述的细胞膜蛋白选自癌细胞膜蛋白、红细胞膜蛋白、中性粒细胞膜蛋白、血小板细胞膜蛋白、巨噬细胞膜蛋白、自然杀伤细胞膜蛋白或以二聚体或四聚体的形式存在的葡萄糖转运蛋白1、Neurothelin/HT7、血清γ谷氨酰转肽酶、P-糖蛋白、PD-1配体PDL1/PDL2、Fas配体FasL、免疫共刺激蛋白B7-H4、膜相关补体调控蛋白CRRY以及非经典MHC I类分子。
[0027]在本发明的技术方案中，步骤3)的方法为将膜蛋白与脂质体分散均匀，然后以脂质体挤出器进行挤出，制备具细胞膜蛋白的脂质体。
[0028]在本发明的技术方案中，去除游离细胞膜蛋白的方法为透析或超速离心过滤。[0029]本发明所述的脂质体在制备近红外二区荧光检测试剂中的用途。
[0030]在本发明的技术方案中，近红外二区荧光检测试剂能够应用于水溶液、磷酸盐缓冲液、培养基或人体或动物体体内外体液或血液中。
[0031]在本发明的方案中，所述的近红外二区为是指波长位于1000-1700nm的光波区段。[0032]优选地，
近红外二区选自波长位于1000-1400nm的光波区段。
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