(10)申请公布号 (43)申请公布日 2013.12.04C N 103421081 A (21)申请号 201210162683.1
(22)申请日 2012.05.24
C07K 1/20(2006.01)
(71)申请人昆明积大制药股份有限公司
地址650106 云南省昆明市国家高新技术产
业开发区科新路389号
(72)发明人曹天海 张荧 何增林
(54)发明名称
(57)摘要
本发明提供一种去除多肽中三氟醋酸的方
法，其步骤为：将含有三氟醋酸的多肽通过反相
柱至三氟醋酸出峰即可。本方法所采用的设备
简单，生产工艺简洁，能有效去除多肽中的三氟醋
酸。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页(10)申请公布号CN 103421081 A
*CN103421081A*
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1.一种采用反相高效液相法去除多肽中三氟醋酸的方法，其特征在于流动相为醋酸钠溶液和乙腈。
2.如权利要求1所述的采用反相高效液相法去除多肽中三氟醋酸的方法，其特征在于，所述流动相中醋酸钠溶液的浓度为0.1mol/L 至1mol/L 。
3.如权利要求1或2所述的采用反相高效液相法去除多肽中三氟醋酸的方法，其特征在于，所述流动相中乙腈的体积比为1%~50%。
4.如权利要求1或2所述的采用反相高效液相法去除多肽中三氟醋酸的方法，其特征在于，所述流动相中醋酸钠溶液的体积比为50%~99%。
5.如权利要求1或2所述的反相高效液相法去除多肽中三氟醋酸的方法，其特征在于，所述谱柱的填料类型为C4（丁基键合硅胶）、C8（庚基键合硅胶）或C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱。权 利 要 求 书CN 103421081 A
一种去除多肽中三氟醋酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种有机化合物的高效液相谱分离方法，尤其是涉及一种多肽化合物中有机酸的反相高效液相谱去除方法。
背景技术
[0002] 三氟醋酸（Trifluoroacetic acid，又翻译为三氟乙酸）是多肽固相合成中Fmoc （9-芴甲氧碳基）保护策略中常用的裂解试剂，也是多肽纯化过程中流动相中常用的离子对试剂。三氟醋酸的酸性较强，一般与多肽结合成盐存在。
[0003] 然而，由于三氟醋酸对人体有害，必须在纯化后通过脱盐或转化成醋酸盐去除。[0004] 文献（J. Pept. Sci. 2008; 14: 354-359）报道去除三氟醋酸的方法一般有三种：
第一，采用反相高效液相谱法，流动相为1%醋酸水溶液，经过较长时间的洗脱去除三氟醋酸；
第二，采用离子交换树脂法，使用强阴离子交换树脂（AG1-X8，季铵），将树脂用醋酸多次清洗后，将多肽溶液倒在树脂上，经过1小时的旋转搅拌，过滤，收集滤液，即可除去三氟醋酸；
第三，去质子化/重新质子方法，将多肽溶解于4℃的去离子水中，缓缓加入100 mM的氢氧化钠溶液至溶液的pH值为11，溶液在4℃保持10分钟。在此条件，多肽将不溶解并产生沉淀，将混悬液在4℃离心，除去含有三的上清液，将颗粒物分散在6倍量去离子水中离心去除所有的三，即可得到中性形式的多肽。
[0005] 专利CN101372506A公开了采用离子交换谱法去除爱啡肽中三氟醋酸的方法。[0006] 专利CN101696236A公开了采用高效液相谱法除去阿托西班中三氟醋酸的方法，所用的流动相为0.3%的醋酸水溶液和乙腈混合液。
[0007] 专利CN101525382A公开了去除普兰林肽中三氟醋酸的方法，先用磷酸盐水溶液和乙腈作为流动相使三氟醋酸盐转化为磷酸盐，再用阴离子交换谱将磷酸盐转化为醋酸盐。
[0008] 综上所述，能够工业化去除多肽中三氟醋酸的方法主要有反相高效液相法和阴离子交换谱法。两种方法相比，反相高效液相法更具有优势。首先，反相高效液相法不需要增加新的设备即可完成去除三氟醋酸和转化成醋酸盐的操作；其次，阴离子交换谱过柱时，药物与离子交换树脂接触，可能导致树脂污染药液，从而引入杂质；第三，阴离子交换谱法增加了工艺步骤，会导致生产成本增加。
[0009] 实践中我们发现反相高效液相法采用醋酸水溶液和乙腈时也存在一定的问题。如果醋酸水溶液浓度过较低，比如0.3%的醋酸水溶液，经过洗脱，无法完全去除三氟醋酸；如果醋酸水溶液浓度过高，特
别是超过1%以后，会导致多肽谱峰拖尾，影响收率。因此，需要一种高效、简单的反相高效液相谱法去除多肽中的三氟醋酸。
发明内容
[0010] 为了解决上述技术问题，本发明人进行了大量试验，发现采用醋酸钠水溶液和乙腈混合液为流动相，不需要增加新的设备即可完成去除三氟醋酸和转化成醋酸盐的操作。[0011] 此方法和文献报道的方法相比，只是把醋酸水溶液更换成为醋酸钠水溶液，原理在于醋酸钠为强碱弱酸盐，浓度为1 mol/L以下的醋酸钠水溶液pH值为7-8，略呈碱性，与醋醋水溶液呈酸性条件下相比醋酸根离子浓度更高，更容易将三氟醋酸阴离子从反相填料上交换下来。此外，在碱性条件下，三氟醋酸阴离子不易形成三氟醋酸，更容易从谱柱中洗脱下来。
[0012] 我们使用的方法为，采用反相高效液相谱系统，进样后，以醋酸钠水溶液和乙腈混合液为流动相，洗脱至样品的三氟醋酸出峰后即可。
[0013] 试验中，我们发现，高效液相谱系统流动相中醋酸钠溶液的浓度为0.1 mol/L至1 mol/L为佳；流动相中乙腈：醋酸钠溶液的体积比为1/99-1/1为佳；谱柱可以根据多肽保留时间的不同选用C4（丁基键合硅胶）、C8（庚烷基键合硅胶）或C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱。
[0014] 三氟醋酸作为残留溶剂，美国药典34版中醋酸戈那瑞林（Gonadorelin Acetate）规定其限度为不得过0.25%。本发明中三氟醋酸的含量测定采用了中国药典2010年版二部附录ⅦN合成多肽中的醋酸测定法，并进行了相应的方法学验证，结果表明该法也适用于合成多肽中三氟醋酸的测定。
[0015] 具体方法如下：
对照品溶液的制备取三氟醋酸适量，精密称定，用流动相A-流动相B（95：5）的混合溶液定量稀释制成每1 ml中约含0.02 mg的溶液。
[0016] 供试品溶液的制备取多肽适量，精密称定，流动相A-流动相B（95：5）的混合溶液定量稀释制成每1 ml中约含5 mg的溶液。
[0017] 谱条件及系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂（250mm×4.6mm，5μm）；以磷酸溶液（在1000ml水中加磷酸0.7ml，用氢氧化钠试液调节pH值至3.0）为流动相A；甲醇为流动相B；流速为每分钟1.2ml；检测波长为210nm。按下表进行梯度洗脱。理论板数按三氟醋酸峰计算应不低于2000。三氟醋酸峰的保留时间约在2~5分钟。梯度洗脱开始后，多肽被洗脱，基线急剧升高。
时间/分流动相A/%流动相B/%
0~5955
5~105050
10~205050
20~22955
22~30955
[0018] 测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别注入液相谱仪，记录谱图，按外标法以峰面积计算多肽中三氟醋酸的含量。
具体实施方式
[0019] 以下实施例仅用于对本发明进行举例说明，并无意于限定本发明的范围。[0020] 以下为采用已有技术和本发明方法去除醋酸去氨加压素中三氟醋酸的比较例。[0021] 实施例1
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为0.1 mol/L醋酸水溶液-乙腈（95：5），经过较长时间的洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为1.2%，远高于可以接受的三氟醋酸的限度（0.25%）。
[0022] 取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为0.25mol/L醋酸钠溶液-乙腈（95：5），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0023] 在上述比较例1中，采用的是醋酸水溶液-乙腈体系作为流动相；在比较例2中，采用的是醋酸钠溶液-乙腈；结果表明比较例2去除三氟乙酸的能力明显优于比较例1。[0024] 实施例2
取经含三氟醋酸的溶液裂解（切肽）并氧化后的生长抑素溶液，采用反相高效液相谱法，C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为0.5mol/L醋酸钠溶液-乙腈（95：5），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品经纯化、冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0025] 实施例3
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C4（丁烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为0.75mol/L醋酸钠溶液-乙腈（95：5），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0026] 实施例4
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C8（庚烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（95：5），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0027] 实施例5
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C4（丁基键合硅胶）反相谱柱，流动相为1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（99：1），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0028] 实施例6
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C18（十八烷基键合硅胶）反相谱柱，流动相为1mol/L醋酸钠溶液-乙腈（50：50），经过洗脱直至三氟醋酸出峰。样品冻干后按照上述验证后的中国药典2010年版二部附录Ⅶ测定样品中三氟醋酸的含量，结果为未检出。
[0029] 实施例7
取经含三氟醋酸的流动相纯化后的醋酸去氨加压素溶液，采用反相高效液相谱法，C18（十八烷基键
合硅胶）反相谱柱，流动相为0.5mol/L醋酸钠溶液-乙腈（95：5），经过
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