[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公开说明书
[11]公开号CN 1831122A
[43]公开日2006年9月13日
[21]申请号200610056800.0[22]申请日2006.03.09
[21]申请号200610056800.0
控制所
地址100052北京市宣武区迎新街100号
[72]发明人阮力 朱既明 娄元梅 陆柔剑 [51]Int.CI.C12N 7/01 (2006.01)C12N 7/04 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 11 页 附图 2 页
[54]发明名称
[57]摘要
去除了与宿主范围和毒力相关的26个基因，总长21,
243个核苷酸，获得了复制缺陷型天坛株痘苗病毒，
生高滴度病毒，在人源细胞中不能有效繁殖，不产
生或仅产生极低滴度子代病毒，但保留了与原天坛
株痘苗病毒相近的DNA复制、RNA转录和蛋白表达的
效果好，可广泛应用于外源基因表达和基因工程疫
苗研究。
200610056800.0权 利 要 求 书第1/1页
1.一种在人源细胞中不能有效繁殖但在鸡胚细胞中繁殖良好的复制缺陷型天坛株痘苗病毒NTV，其特征是：NTV的原始毒株为天坛株痘苗病毒，与原始毒株相比NTV基因组去除了Hind III内切酶C到K片段间位于基因组第5,497位到第26,741位之间的21,243个核苷酸序列，去除的核苷酸序列中含有T C1L至T C19L、T N1L至T N2L、T M1L至T M2L
及T K1L至T K3L总共26个基因，N T V在鸡胚细胞中繁殖良好，能产生高滴度病毒，在人源细胞中不能有效繁殖，不产生或仅产生极低滴度的子代病毒，但保留了与原始毒株相近的DNA复制、RNA转录和蛋白合成的能力，外源基因表达高，免疫效果好，毒力明显下降。
2.按权力要求1所述的痘苗病毒NTV，其特征是：NTV由原始天坛株痘苗病毒与含其HindIII 内切酶C和K
片段同源序列的重组质粒p N e o C K经细胞内同源重组获得，p N e o C K质粒含有天坛株痘苗病毒HindIII内切酶C片段第4,976位到第5,497位核苷酸序列和HindIII
内切酶K片段第26,741位到27,107位核苷酸序列，通过细胞内同源重组能够去掉其间含26个基因的21,243个核苷酸序列。
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复制缺陷型天坛株痘苗病毒
技术领域
本发明总的涉及基因工程技术，特别涉及以痘苗病毒为载体的基因工程疫苗。
背景技术
痘苗病毒宿主泛围广，繁殖滴度高，非必需基因多，外源基因容量大(理论上可达25Kb)，
在胞浆复制，无致癌性，免疫力持久，有长期人体应用历史，这种独特的生物学及分子生物
学性状引起了病毒学家和分子生物学家将其开发成基因工程载体的极大兴趣，。自1982年以
来，已有100多种外源基因在痘苗病毒中获得表达，其中表达甲肝、乙肝、麻疹、人乳头瘤、
HIV、EBV等病毒抗原的重组痘苗病毒已经进行了小量人体免疫实验，痘苗病毒已成为近十
几年来发展最快的病毒载体之一[1-4]。然而，痘苗病毒存在的较强局部发痘反应和少量严重
并发症，如：进行性发痘和种痘后脑炎等，严重阻碍了以该病毒为载体的重组疫苗的广泛应
用。因此，降低痘苗病毒的毒副作用，保持甚至增强其免疫效果已成为病毒学家及分子生物
学家关注及研究的重要问题。
在研究早期，降低痘苗病毒毒副作用主要从以下两个方面进行。一是删除痘苗病毒某些
毒力相关基因。有资料表明：一些痘苗病毒非必需基因与该病毒的毒力相关。删除痘苗病毒
宿主范围基因C7L、K1L可不同程度地降低其在不同宿主(包括人)细胞中的繁殖能力[5-7]。
痘苗病毒免疫抑制相关基因通过其编码类淋巴因子受体(TNFR、IL-1R、IFNγR)、干扰素抗性
蛋白(F3L、K3L)、抗补体活性蛋白VCP及丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)等，从而直接或间接地干
扰、削弱或阻断宿主对痘苗病毒的特异性或非特异性反应，增强其毒力[8]。另外，胸苷激
酶基因J2R、核糖核苷酸还原酶基因I4L、F4L等通过不同环节增强毒力[8]。删除上述基因也
可不同程度地降低痘苗病毒的毒副作用。二是有目的地引入一些具有特定调节免疫反应的淋
巴因子。已知，长期(或终生)保护性免疫的产生与维持依赖于有效的免疫接种，对许多人类
及动物疾病，保护性的获得取决于诱生的免疫反应类型。而免疫反应类型或走向(细胞或体液
免疫)主要受Th细胞亚类产生的细胞因子控制[9]。一些研究表明：表达细胞因子如IL-2、IL-5、
IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF等的重组痘苗病毒可降低痘苗病毒的毒力或选择性地增强外源抗
原的免疫反[10-14]。
然而，上述研究都是在保留痘苗病毒能在人体细胞繁殖的前提下进行的，因为按经典接
种方法只有保留这种繁殖能力才能获得有效免。这就产生了两方面的问题：一是为获得有效
免疫，就必须保持较好的病毒繁殖能力，这就很难解决因病毒大量繁殖引起的严重种痘并发
症问题；二是病毒繁殖能力明显降低后，毒性和并发症降低了，但却不能达有效免疫。因此，
在经典接种方法的框架内(即通过病毒在受试者身上繁殖来诱发有效免疫)，很难在确保有
效免疫的前提下，解决痘苗病毒免疫引起的严重并发症或毒性问题。
为了解决这一问题，Taylor等1988年[15]提出了“非复制型痘病毒载体”的概念。他们
利用仅在禽类细胞中繁殖的鸡痘病毒(FPV)作为载体，构建了表达狂犬病毒包膜糖蛋白的重组鸡痘病毒。该重组病毒在人及其它非禽细胞中均不繁殖，因此非常安全，而且可以较好表达外源抗原，并引起非禽种系动物有效的免疫反应，但免疫反应较弱。他们在1991年又发现，金丝雀痘病毒(CPV)以及其减毒疫苗株ALVAC较FPV更为有效，并进行了小批量人体试验，取得了较好效果[16，17]。该载体十分安全，但总体免疫反应弱，病毒用量较大，给实际应用带来一定困难。1992年，Tartaglia等将该策略运用在痘苗病毒载体中。他们选择作为疫苗曾在人体中使用过的痘苗病毒哥本哈根(Copenhagen)株作为出发毒株，通过基因重组技术去除该病毒18个基因，构建成功在人源细胞失去繁殖能力的非复制型哥本哈根(Copenhagen)株重
组痘苗病毒NYVAC[18]。去除的18个基因中包括2个宿主范围基因K1L和C7L及16个毒力相关基因J2R，I4L，A56R，A26L，B13R/B14R，C1-6L，N1-2L和M1-2L。其中一些基因涉及到病毒DNA 的复制，如
核糖核苷酸还原酶大亚基样基因I4L等。NYVAC的基本性状与FPV和ALVAC相近，也是病毒载体十分安全，但免疫反应弱，病毒用量较大，给实际应用带来一定困难。特别是不适用于那些需要诱发很强免疫反应才能达到免疫保护的疫苗研究。
综上所述，非复制型痘病毒载体研究进展为从根本上解决其毒副作用带来了望。但现有的这类病毒载体都有一个共同特点：病毒载体DNA在人源细胞中的复制能力受到严重响，在病毒感染早期其DNA复制就被阻断[16，18]。这一方面是其作为人用疫苗载体十分安全的原因，另一方面也是其免疫反应弱，病毒用量较大，而且在鸡胚细胞中繁殖滴度也不高的重要原因。上述问题的解决，有可能导致安全高效的新一代非复制型重组痘病毒载体的产生。
发明内容
发明目的为了解决上述现有技术中存在问题，本发明的目是：利用免疫原性较强的中
国天坛株痘苗病毒为出发毒株，构建在鸡胚细胞中能良好繁殖，而在人源细胞中不能繁殖或繁殖很差，但却保留了良好的DNA复制、RNA转录与蛋白翻译功能的安全高效的复制缺陷型天坛株痘苗病毒，用于外源基因表达和基因工程疫苗的研究。
实施原则本发明可以通过下列方法和原则实现：①使用免疫原性较强的中国天坛株痘
苗病毒为出发毒株；②通过基因重组技术，去除与宿主范围及毒力相关的基因，在缺失这些基因时，尽量避免损伤与病毒DNA复制、RNA转录和蛋白翻译有关的基因；③病毒重组在其能够繁殖的鸡胚细胞中进行，然后同时在鸡胚细胞和人源细胞中筛选，以获得在鸡胚细胞中繁殖良好，但在人源细胞中不能繁殖或繁殖很差的复制缺陷型天坛株痘苗病毒；④再对该病毒基因组特点、繁殖能力、毒力变化、基因表达水平和免疫效果等进行检定，确定其基本的生物学和分子生物学特征。
主要优点本发明的主要优点是：由于保留了良好的DNA复制、RNA转录与蛋白翻译功能，复制缺陷型天坛株痘苗病毒不但具备一般非复制型痘病毒的特点，而且还具备一般非复制型痘病毒所没有的外源基因表达高、免疫效果好、病毒用量少的优点。
发明内容本发明的主要内容是：使用中国天坛株痘苗病毒，参考Copenhagen株痘苗病
毒序列[19]，通过基因重组技术，从其基因组HindIII内切酶标记的C到K片段中去除了与宿主
范围及毒力相关的26个基因，共21，243个核苷酸序列，构建成功了复制缺陷型天坛株重组痘
苗病毒，命名为NTV。去除的21，243个核苷酸位于天坛株痘苗病毒基因组核酸序列第5，497位
至26，741位，去除的26个基因分别为：C片段中C1L至C19L的19个基因，N片段中N1L至N2L的2
个基因，M片段中M1L至M2L的2个基因，K片段中K1L至K3L的3个基因。该病毒在鸡胚细胞中保
持了良好的繁殖能力，可产生高滴度病毒，在人源细胞中不能有效繁殖，不产生或仅产生极
低滴度的子代病毒，但却保留了与原天坛株痘苗病毒相近的DNA复制、RNA转录与蛋白翻译能
力，病毒毒力明显下降，外源基因表达高，免疫效果好。复制缺陷型天坛株重组痘苗病毒NTV
是一种可用于外源基因表达和基因工程疫苗研究的新型病毒载体。
附图说明
附图1说明
本图为重组质粒pNeoCK和pNeoCKLac构建与结构示意图。图中bp为核苷酸碱基对，kb为
千个核苷酸碱基对，J6R和P11及P25为痘苗病毒启动子，BamHI、SacI、KpnI、SmaI、EcoRI、SalI、XbaI、XhoI、BglII、PstI和SstI均为限制性内切酶，Neo为新霉素基因，Amp为氨基
苄青霉素抗性基因，Lac为半乳糖苷酶基因，Klenow为DNA聚合酶基因。
质粒pNeoCK和pNeoCKLac的构建：
经PCR扩增、克隆和测序正确的用于天坛株痘苗病毒同源重组的C’(530bp)和K’(370bp)
片段，按其在痘病毒基因组的方向连接并克隆到pBR-Neo质粒中，获得质粒pNeoCK。将
pGEM-34XRLac质粒中带痘苗病毒启动子的Lac基因经内切酶切出后克隆到pNeoCK质粒的C和K
片段之间的克隆位点BamHI中获得质粒pNeoCKLac。
质粒结构的说明：
质粒pBR-Neo：该质粒为经典质粒pBR322经内切酶EcoRI和BglII水解后，将含复制起点
和氨基苄青霉素抗生(Amp r)的载体片段(2.3kb)与痘苗病毒J6R启动子片段(0.1kb)和新
霉素基因Neo(1kb)连接重组而成，质粒大小为3,400bp(或3.4kb)。
质粒pGEM-34XRLac：该质粒为经典pGEM质粒(2.95kb)的多克隆位点中插入痘苗病毒P11
和P25双向启动子片段(0.2kb)及Lac基因(4.85kb)构建而成，质粒大小为8,000bp(或8.0kb)。
质粒pNeoCK：该质粒是在pBR-Neo质粒多克隆位点SmaI和SalI插入按痘苗病毒基因组方
向连在一起的同源重组序列C’(0.530bp)和K’(0.370bp)构建而成。除C’和K’成分外(质粒
中标为C的即为C’，标为K的即为K’)，该质粒的其它组成均与pBR-Neo相同，质粒大小为4,300bp (或4.3kb)。
质粒pNeoCKLac：该质粒是在pNeoCK质粒的C和K片段间的多克隆位点BamHI插入带痘苗病
毒启动子P11和P25(0.2kb)的Lac基因(4.85kb)构建而成。除了带痘苗病毒启动子的Lac
基因外，其它组成均与pNeoCK相同，质粒大小为9,350bp(或9.4kb)。
附图2说明
本图为复制缺陷型天坛株重组痘苗病毒VHFIL2ΔCKSS1和复制型天坛株重组痘苗病毒
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