(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201380065016.4
(22)申请日 2013.12.20
61/740,829 2012.12.21 US
C12P 13/04(2006.01)C12N 15/52(2006.01)C12N 15/70(2006.01)
(71)申请人刘平华
地址美国马萨诸塞州
申请人宋恒 胡文
(72)发明人刘平华 宋恒 胡文
(74)专利代理机构北京戈程知识产权代理有限
公司 11314
代理人
程伟
(54)发明名称
(57)摘要
本公开的内容有关于通过体外酶促转化或使
用通过代谢工程制造的微生物发酵生产麦角硫因
(ergothioneine)。并揭露对此方法有用的经转化
细胞(transformed cell)和以此方法生产的麦 角硫因。本公开的经转化细胞比起未经转化的野
生型细胞，能够以较好的效率将组氨酸和半胱氨
酸或组氨酸甜菜碱(hercynine)和半胱氨酸转变
成为麦角硫因。
(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2015.06.11
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/US2013/077287 2013.12.20
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2014/100752 EN 2014.06.26(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书26页 附图6页(10)申请公布号CN 104854245 A (43)申请公布日2015.08.19
C N 104854245
A
1.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括：(i)以包括重组地表达：(a)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(c)EgtC 蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(d)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(e)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物培育组氨酸或组氨酸甜菜碱；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。
2.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括：(i)以包括重组地表达：(a)OvoA蛋白质、NcEgtl蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(b)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物培育组氨酸甜菜碱；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。
3.一种用于制备麦角硫因的过程，该过程包括培育：(i)组氨酸和包含重组地表达：
(a)EgtD蛋白质蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、(b)OvoA蛋白质、NcEgal蛋白质或保留酶活性的其功能性片段、和(c)EgtE蛋白质或保留酶活性的其功能性片段的反应混合物；以及(ii)自该酶混合物中分离麦角硫因。
4.如权利要求1或3所述的过程，其中该EgtD蛋白质是和有SAM合成酶编码的基因重组地共表达。
5.如权利要求1至4任一项所述的过程，其中该EgtE蛋白质是和有FAD合成酶编码的基因重组地共表达以为了促进EgtE生产。
6.如权利要求1至5任一项所述的过程，其中该酶混合物进一步包括甲硫氨酸或半胱氨酸。
7.如权利要求1至6任一项所述的过程，其中该酶混合物进一步包括铁盐。
8.如权利要求1至7任一项所述的过程，其中该反应混合物包括细胞溶解产物。
9.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：
(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：EgtA、EgtB、EgtC、EgtD、EgtE基因；以及
(ii)在该培养基或细胞团块中累积麦角硫因且此后自其中回收麦角硫因。
10.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：
(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：(a) ovoA基因或NcEgt-1；和(b)egtE基因；以及
(ii)在该培养基或细胞团块中累积麦角硫因且此后自其中回收麦角硫因。
11.一种制备麦角硫因的过程，该过程包括：
(i)在适当的培养基中，适当的代谢条件下培养细胞，其中该细胞重组地表达：(a) egtD基因；(b)ovoA基因或ncEgt-1基因；和(c)egtE基因；以及
(ii)在该培养基或细胞团块中累积麦角硫因且此后自其中回收麦角硫因。
12.如权利要求11所述的过程，其中该细胞重组地表达有S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶编码的基因。
13.如权利要求9至12任一项所述的过程，其中该细胞重组地表达有FAD合成酶编码的基因以为了促进EgtE生产。
14.如权利要求9至13任一项所述的过程，其中该细胞重组地表达一或多个有铁载体编码的基因。
15.如权利要求9至14任一项所述的过程，其中该细胞正常生产麦角硫因。
16.如权利要求9至15任一项所述的过程，其中该细胞为细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、或植物细胞。
17.如权利要求16所述的过程，其中该细菌细胞为大肠杆菌细胞。
18.如权利要求9至17任一项所述的过程，其中该培养基进一步以铁盐补充。
19.如权利要求9至18任一项所述的过程，其中该培养基进一步以其它甲硫氨酸、组氨酸甜菜碱、组氨酸、或半胱氨酸中的一或多种补充。
20.如权利要求9至19任一项所述的过程，其中该重组地表达的基因中的一或多个是由一或多个表达载体或质粒所表达。
21.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该egtD基因、该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、该有FAD合成酶编码的基因、和该有SAM合成酶编码的基因被不同载体表达。
22.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE 基因、和该有FAD合成酶编码的基因被一个载体表达。
23.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该egtD基因和该有该SAM合成酶编码的基因被一个载体表达。
24.如权利要求9至20、22或23任一项所述的过程，其中该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、和该有FAD合成酶编码的基因被一个第一载体表达以及该egtD基因和该有SAM合成酶编码的基因被一个第二载体表达。
25.如权利要求9至20、22或23任一项所述的过程，其中该egtD基因、该ovoA基因或ncEgt-1基因、该egtE基因、该有FAD合成酶编码的基因和该有SAM合成酶编码的基因全部被相同载体表达。
26.如权利要求9至20任一项所述的过程，其中该重组地表达的基因中的一或多个被融入细胞的该基因体中。
27.如权利要求11至26任一项所述的过程，其中该egtD基因的产物催化组氨酸至组氨酸甜菜碱的转换。
28.如权利要求11至27任一项所述的过程，其中该ovoA基因或该ncEgt-1基因的产物催化组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合。
29.如权利要求9至28任一项所述的过程，其中该egtE基因的产物催化该组氨酸甜菜碱和半胱氨酸之间的氧化耦合产物中C-S键结的裂解。
30.通过如权利要求1至29任一项所述的过程所生产的麦角硫因。
通过代谢工程生产麦角硫因
[0001] 相关申请
[0002] 本申请主张于2012年12月21日所提交第61/740,829号美国专利临时申请案的优先权及利益。该申请的全部内容以整体引用形式并入本文。
[0003] 政府资助
[0004] 本发明在国家卫生研究院所给予的政府资助GM093903和国家科学基金给予的国家资助CHE-0748504下进行。美国政府对本发明具有一定权利。
技术领域
[0005] 本公开的内容通常关于通过无细胞(cell-free)酶促转化或使用由代谢工程所制造的微生物发酵生产麦角硫因。
背景技术
[0006] 麦角硫因是由Tanret在1909年自麦角(ergot)中分离出的包含硫醇基(thiol)的氨基酸。其独特的氧化还原特性使它成为最好的天然抗氧化剂之一。此外，由于它被许多人类组织(如，肝、肾、中枢神经系统、和红血球)从食物中特异性富集，麦角硫因被认为是在人类生理中具有许多好处的角。近来，麦角硫因被广泛使用作为具有数十亿美元市场的抗老化产品的关键成分。
[0007] 麦角硫因是由两种氨基酸(组氨酸和半胱氨酸)经五个酶促步骤生产。然而，阻碍使用目前已知通过发酵生产的麦角硫因生物合成途径的主要障碍有三个：(1)EgtE酶不能被过度表达；(2)EgtB的活性低；(3)麦角硫因和谷胱甘肽之间对y-Glu-Cys的潜在竞争，将限制产量。因此，目前麦角硫因是使用化学手段生产，因此该领域中仍有麦角硫因的重组生物合成的需要。
发明内容
[0008] 本文提供一种新颖的酶促方法以及一种代谢工程方法用以在无细胞酶促系统或细胞培养系统中提高、增加或最大化麦角硫因的生产。该无细胞系统和使用通过本文所揭露代谢工程所制造的基因工程微生物(engineered microbial)的细胞培养系统可用于生产较高层次的麦角硫因。本文中所述的这些过程是基于发明人的发现：1)在大肠杆菌(E.coli)中成功生产EgtE和确认改善EgtB活性的条件，其使通过无细胞转化或通过发酵以使用目前已知的麦角硫因生物合成途径来生产麦角硫因变得可能。2)一种
来自该ovothiol生物合成途径的酶(OvoA)可用于催化Cys和三甲基-组氨酸的直接氧化耦合以生产在麦角硫因生物合成中所需的关键中间产物。这样的发现是令人惊讶且意想不到的，因为OvoA亦催化Cys和His的氧化耦合生产结构上完全不同的化合物。不希望被任何理论所束缚，新发现的OvoA活性可以两个步骤缩短麦角硫因的生物合成途径且可排除麦角硫因和glutathioneine生物合成的间的竞争。基于该新发现的OvoA化学，麦角硫因可通过无细胞酶促系统或细胞培养系统而生产。3)另一种酶NcEgtl亦能够催化Cys和三甲基-组
氨酸的直接耦合。基于该新发现的NcEgtl化学，麦角硫因可通过无细胞酶促系统或细胞培养系统而生产。
[0009] 因此，提供于本文的某些方面是关于包括重组地表达一或多个该麦角硫因生物合成途径的基因和一或多个ovothiol生物合成途径的基因或通过生物信息学手段识别的其同源物(homolog)(如NcEgtl)的体外无细胞系统。另一方面涉及代谢工程生产的微生物品系使用这些酶通过发酵以生产麦角硫因。
[0010] 一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtA基因；(ii)egtB基因；(iii)egtC 基因；(iv)egtD；以及(iv)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细胞进一步表达有SAM合成酶编码的基因。
[0011] 一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)ovoA基因或ncEgt-1基因或其通过生物信息学识别的
同源物；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。
[0012] 一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因；以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。一些具体实施例中，该细胞重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因：以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因；以及(iv)有SAM合成酶编码的基因。
[0013] 本文提供的一些方面有关于细胞培养基、无细胞酶促混合物、或将自本文中所述的任一方面或具体实施例的发酵中收集的细胞溶解后的上清液。
[0014] 本文提供的其它方面有关于一种方法，包括于本文中所述的任一方面或具体实施例的细胞培养基中培养。
[0015] 本文提供的其它方面是有关于一种方法，包括培育(incubating)自本文中所述的细胞溶解所获得的细胞萃取物。
[0016] 本文所述的各方面有关于一种方法，其包括在细胞中重组地表达该麦角硫因生物合成途径的一或多个基因和该ovothiol生物合成途径的一或多个基因或通过生物信息学识别的其它同源物(如NcEgtl)。
[0017] 提供于本文的一些方面有关于制备麦角硫因的方法。
[0018] 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)EgtA蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(ii)EgtB蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iii)EgtC蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(iv)EgtD蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；(v)EgtE 蛋白质或保留酶活性的其功能性片段；以及(vi)有FAD合成酶编码的基因或保留酶活性的其功能性片段。
[0019] 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)ovoA或ncEgt-1基因或通过生物信息学识别的其它同源物；以及(ii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。[0020] 一些具体实施例中，该方法包括在细胞中重组地表达：(i)egtD基因；(ii)ovoA基因或ncEgt-1基因或通过生物信息学识别的其它同源物；以及(iii)egtE基因和有FAD合成酶编码的基因。
[0021] 一些具体实施例中，本文所述的方法进一步包括在细胞培养基中培养本文所述的细胞。
[0022] 一些具体实施例中，本文所述的方法包括在细胞培养基中培养本文所述的细胞，其中该培养基以半胱氨酸、组氨酸或组氨酸甜菜碱补充。
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