(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910957229.7
(22)申请日 2019.10.10
(71)申请人 北京化工大学
地址 100013 北京市朝阳区北三环东路15
号
(72)发明人 袁其朋 孙新晓 唐二菊
(74)专利代理机构 郑州德勤知识产权代理有限
公司 41128
代理人 王莉
(51)Int.Cl.
C12N 1/21(2006.01)
C12N 15/55(2006.01)
C12N 15/61(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12P 7/18(2006.01)
C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明提供了一种生产肌醇的工程菌，
包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，所述质粒
或同时导入了编码肌醇-1-磷酸合成酶的基因和
过表达编码肌醇单磷酸酶的基因。本发明还提供
了一种上述生产肌醇的工程菌的构建方法和应
用。上述工程菌在利用上述外源酶的同时过表达
内源酶，并结合RED重组进行基因调控，逐步提高
肌醇的产量以及碳源收率，从而实现以蔗糖、葡
萄糖和甘油等简单碳源为源头，通过生产与生长
相互协调，实现宿主的快速生长和肌醇的高效生
产。
权利要求书1页 说明书9页序列表1页 附图3页CN 112646760 A 2021.04.13
C N 112646760
A
1.一种生产肌醇的工程菌，其特征在于：包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，其中，所述质粒载体中导入了编码肌醇-1-磷酸合成酶的基因，或同时导入了编码肌醇-1-磷酸合成酶的基因和过表达编码肌醇单磷酸酶的基因。
2.根据权利要求1所述的生产肌醇的工程菌，其特征在于：所述宿主菌中敲除了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的zwf和编码葡萄糖磷酸异构酶基因的pgi的同时，还敲除了编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU、编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的glgC、编码甘油脱氢酶基因的gldA、编码丙酮酸激酶的基因pykA和pykF中的至少一种基因。
3.根据权利要求2所述的生产肌醇的工程菌，其特征在于：所述宿主菌中同时还敲除了编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU和编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的glgC。
4.根据权利要求2或3所述的生产肌醇的工程菌，其特征在于：所述宿主菌中同时还敲除了编码甘油脱氢酶基因的gldA、编码丙酮酸激酶的基因pykA和pykF。
5.根据权利要求4所述的生产肌醇的工程菌，其特征在于：所述宿主菌中还敲除了编码甘油激酶的基因glpK。
6.根据权利要求5所述的生产肌醇的工程菌，其特征在于：所述质粒载体中还导入了过表达编码甘油激酶的基因glpK。
7.一种权利要求1～6所述的生产肌醇的工程菌的构建方法，包括步骤：
重组表达质粒 将编码所述肌醇-1-磷酸合成酶的基因连接至表达质粒上进行重组，或者将编码肌醇-1-磷酸合成酶和肌醇单磷酸酶的基因连接至所述表达质粒上进行重组，获得所述质粒载体；
构建工程菌 将所述质粒载体转化到所述宿主菌中，得到生产肌醇的工程菌。
8.根据权利要求7所述的生产肌醇的工程菌的构建方法，其特征在于：在所述重组表达质粒的步骤中，编码肌醇-1-磷酸合成酶的基因、编码肌醇单磷酸酶的基因和甘油激酶的基因glpK中的至少一种基因采用组成型启动子进行PCR扩增处理，该组成型启动子的基因序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
9.一种生产肌醇的工程菌的应用，其特征在于：按照体积比1%～5%的接种量，将权利要求1～6任一项所述的生产肌醇的工程菌接种到培养基中，并加入诱导剂，在20℃～37℃、pH 为5～8的条件下进
行发酵处理，制得肌醇；所述培养基中的碳源为蔗糖、葡萄糖、或者选自甘油、蔗糖和葡萄糖中至少两种的组合。
10.根据权利要求9所述的生产肌醇的工程菌的应用，其特征在于：所述培养基包括10～40 g ∙L ‾1所述碳源，1～5 g ∙L ‾1酵母粉，5～8 g ∙L ‾1 NaHPO 4，0.3～2 g ∙L ‾1 NaCl，2～5 g ∙L ‾1 KH 2PO 4，1～5 g ∙L ‾1 NH 4Cl，240～250 mg ∙L ‾1 MgSO 4，14～15.5 mg ∙L ‾1 CaCl 2。
权 利 要 求 书1/1页CN 112646760 A
生产肌醇的工程菌及其构建方法和应用
技术领域
[0001]本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种生产肌醇的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
[0002]肌醇（inositol）又被称为环己六醇、纤维醇、肌糖等，主要存在于动植物体内，是动物、微生物的生长因子，同时也是水溶性维生素B族中的一种。肌醇应用广泛，其主要应用于饲料、食品、医药、化妆品等行业。在饲料行业，肌醇作为饲料添加剂在畜牧业、水产养殖业以及家禽饲养业等方面
需求巨大，其加入量一般为饲料的0.2％～0.5％，尤其在日本仅动物的肌醇消费量每年都在100t以上；实验表明，高等动物如果缺乏肌醇将会引起脱发和生长停滞等症状，而加入肌醇，可以防止脱发和促进生长。在食品行业，肌醇作为营养强化剂在食品工业和发酵中，用于促进酿酒酵母的增长以及各种菌种的培养等；近年来，欧美、日本等国家在婴幼儿食品及营养食品中添加肌醇，赋予食品一定的营养保健功能，尤其在以肌醇为主要成分的维生素功能性饮料中；由于肌醇能与肉毒碱作用而达到降脂功效，因此以肌醇为主要成分的减肥降脂保健食品风靡国际市场。在医药行业，肌醇是一种水溶性维生素，可以各种维生素缺乏症；肌醇可有效糖尿病、抑郁症、肝硬化、肥胖症等多种疾病；肌醇及其其衍生物具有抗癌、治癌、忧郁症等功能。在化妆品行业，利用肌醇具有促进细胞生长和防止老化以及抗氧化的作用，在化妆品中加入肌醇以抑制黑素的产生，防止雀斑的形式，同时延缓衰老，以肌醇为主要成分研发的各种高级化妆品已经成为国际化妆品市场的主力军。
[0003]近年来，肌醇因其用途广泛，需求量每年都在不断上升，我国作为肌醇最大供应国以及生产国，尚且出现供不应求的状况，由此可见，全世界的肌醇产量远远无法满足需求。[0004]肌醇的传统生产方法是加压水解法，该生产方法生产成本高，对设备要求及其严格；操作压力只能控制在一定范围内，限制了原料利用率的提高；粗产品的精制工艺复杂，回收率损失较多；产生的大量磷无法循环利用，对水源污染严重等。为减少能耗，开发了常压水解法，其在常压下进行反应，避免对设备的严格要求，但也存在较多问题。目前，肌醇的生产方法主要是化学合成法，但化学合成工艺复杂，费用
高，污染严重，无法与天然肌醇抗衡，一直未能进行工业性试验。近年来，酶解法成为了研究热点，酶解法新型高效，常温常压，无污染，但酶纯化困难、制备或购买成本高，而且产率较低。水解法、化学合成法、酶解法均存在不同程度的高成本、高污染以及低产率等问题。所以，虽然肌醇应用领域广泛，但由于其价高以及供应问题，一直没有得到广泛应用，因此开发一种成本低、无污染、产率高的生产肌醇的新方法迫在眉睫。
发明内容
[0005]有鉴于此，本发明确有必要提供一种生产肌醇的工程菌及其构建方法和应用，以解决上述问题。
[0006]为此，本发明提供一种生产肌醇的工程菌，包括宿主菌和转入所述宿主菌的质粒载体，其中，所述质粒载体中导入编码肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）的基因，或同时导入编码肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）的基因和过表达编码肌醇单磷酸酶（suhB）的基因。
[0007]其中，所述宿主菌为细菌、酵母或真菌，其中，所述细菌或真菌为原始的或改造过的。优选地，所述宿主菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酿酒酵母或黑曲霉。[0008]基于上述，所述宿主菌中敲除了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的zwf和编码葡萄糖磷酸异构酶基因的pgi的同时，还敲除了编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU、编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的gl
gC、编码甘油脱氢酶基因的gldA、编码丙酮酸激酶的基因pykA和pykF中的至少一种基因。
[0009]基于上述，所述宿主菌中同时还敲除了编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU和编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的glgC。
[0010]基于上述，所述宿主菌中同时还敲除了编码甘油脱氢酶基因的gldA、编码丙酮酸激酶的基因pykA和pykF。
[0011]基于上述，包括所述宿主菌中还敲除了编码甘油激酶的基因glpK。
[0012]基于上述，所述质粒载体中还导入过表达编码甘油激酶的基因glpK。
[0013]本发明还提供一种上述生产肌醇的工程菌的构建方法，包括步骤：重组表达质粒 将编码所述肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）的基因连接至表达质粒上进行重组，或者将编码肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）和肌醇单磷酸酶（suhB）的基因连接至所述表达质粒上进行重组，获得质粒载体；
构建工程菌 将所述质粒载体转化到所述宿主菌中，得到生产肌醇的工程菌。[0014]其中，所述表达质粒可以为pCS27。所述宿主菌利用Red同源重组法，敲除编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的zwf和编码葡萄糖磷酸异构酶基因的pgi的同时，还敲除编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU、编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的glgC、编码甘油脱氢酶基因的gldA、编码丙酮酸激酶的基因pykA和pykF
中的至少一种基因。所述重组表达质粒的步骤中还包括将过表达编码甘油激酶的基因glpK同时连接至所述表达质粒上进行重组获得所述质粒载体；同时，所述宿主菌利用Red同源重组法敲除编码甘油激酶的基因glpK。
[0015]基于上述，在所述重组表达质粒的步骤中，编码肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）的基因、编码肌醇单磷酸酶（suhB）的基因和甘油激酶的基因glpK中的至少一种基因采用组成型启动子进行PCR扩增处理，该组成型启动子的基因序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5。
[0016]本发明还提供一种上述生产肌醇的工程菌的应用，其中，按照体积比1%～5%的接种量，将上述生产肌醇的工程菌接种到培养基中，在20℃～37℃、pH为5～8的条件下进行发酵处理，制得肌醇；所述培养基中的碳源为蔗糖、葡萄糖、或者选自甘油、蔗糖和葡萄糖中至少两种的组合。
[0017]基于上述，所述培养基包括：10～40 g∙L‾1所述碳源，1～5 g∙L‾1酵母粉，5～8 g ∙L‾1 NaHPO4，0.3～2 g∙L‾1 NaCl，2～5 g∙L‾1 KH2PO4，1～5 g∙L‾1 NH4Cl，240～250 mg ∙L‾1 MgSO4，14～15.5 mg∙L‾1 CaCl2。优选地，所述碳源为葡萄糖和甘油的组合物，比如葡萄糖和甘油的比例为(1～3):1，更优选地，葡萄糖和甘油的比例为2:1。
[0018]如图1所示，在本发明提供的上述生产肌醇的工程菌中，蔗糖或葡萄糖经过新陈代谢转化为葡萄
糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate），葡萄糖-6-磷酸经过肌醇-1-磷酸合成酶（ino1）和肌醇单磷酸酶（suhB）催化合成肌醇，从而实现了以蔗糖、葡萄糖、甘油等简单碳源为源头高效生物合成肌醇。
[0019]本发明提供的上述生产肌醇的工程菌引入了基因调控策略，利用Red同源重组进行敲除，敲除了磷酸戊糖途径中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的zwf和糖酵解途径中编码葡萄糖磷酸异构酶基因的pgi，还选择性敲除可催化葡萄糖-6-磷酸的编码葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的galU和编码葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因的glgC，增加了前体葡萄糖-6-磷酸的供应；敲除编码丙酮酸激酶II基因的pykA、编码丙酮酸激酶I基因的pykF，减少磷酸烯醇式丙酮酸PEP的消耗，同时敲除编码甘油脱氢酶基因的gldA，增加磷酸烯醇式丙酮酸PEP的生成，提高葡萄糖的转运效率，增加了肌醇的生成。
[0020]进一步，本发明提供的上述生产肌醇的工程菌中还敲除了宿主菌中编码甘油激酶基因的基因glpK，并向质粒载体中导入过表达编码甘油激酶基因的基因glpK，使生长与生产彻底偶联起来，质粒丢失，则菌株无法生长，所以，有利于工业化生产中监控肌醇合成终点；同时，过表达编码甘油激酶基因的基因glpK可以加快甘油利用，实现宿主的快速生长。[0021]进一步，本发明提供的上述生产肌醇的工程菌中引入组成型启动子，组成型启动子不需要加诱导剂就可以直接表达，而且强度比lac启动子要强，转化效率更高，lac启动子需要加诱导剂，诱导剂本身也有毒性，会延缓菌株的生长；所以，本发明引入组成型启动子替换原有的lac启动子，有利于肌醇的高效生物合成。
[0022]因此，利用本发明提供的上述生产肌醇的工程菌可以实现以蔗糖、葡萄糖和甘油等简单碳源为源头，通过生产与生长相互协调，实现宿主的快速生长和肌醇的高效生产。
附图说明
[0023]图1是本发明提供的生物合成肌醇的路径。
[0024]图2是本发明实施例1提供的工程菌TEJ-11与TEJ-12生产肌醇的发酵结果图。[0025]图3是本发明实施例2提供的工程菌TEJ-21生产肌醇的发酵结果图。
[0026]图4是本发明实施例2提供的工程菌TEJ-21以及本发明实施例3提供的工程菌TEJ-22、TEJ-23、TEJ-24、TEJ-25与TEJ-26在发酵在96 h后生产肌醇的产量柱状图。
[0027]图5是本发明实施例4中提供的工程菌TEJ-31生产肌醇的发酵结果图。
[0028]在序列表中：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5分别表示组成型启动子的DNA序列。
具体实施方式
[0029]下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
[0030]本发明提供的生产肌醇的工程菌，通过向原始菌株或改造过的菌株导入一条高效生产肌醇的途径，选择来源于细菌、真菌或动植物细胞的肌醇-1-磷酸合成酶ino1，通过肌醇-1-磷酸合成酶ino1在宿主中的高效表达，同时过表达内源的肌醇单磷酸酶suhB，利用蔗糖、葡萄糖、甘油等简单碳源实现肌醇的从头合成。
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