(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910419589.1
(22)申请日 2019.05.20
(71)申请人 山东大学第二医院
地址 250033 山东省济南市天桥区北园大
街247号
(72)发明人 亓同钢 王乐乐 赵林林 赵金铭
(74)专利代理机构 济南金迪知识产权代理有限
公司 37219
代理人 陈桂玲
(51)Int.Cl.
C12N 15/85(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
A01K 67/027(2006.01)
(54)发明名称
建方法及其应用
(57)摘要
本发明涉及一种PSMD11基因条件性敲除小
鼠模型的构建方法及其应用。本发明中的一种
PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，是
通过将PSMD11基因的第5外显子敲除，从而实现
失活整个基因，首次获得了PSMD11基因条件性敲
除小鼠模型。PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性
方面都起到非常关键的作用，而且PSMD11蛋白还
被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡，本发明构
建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型为进
一步研究PSMD11基因的生物学功能奠定了基础。权利要求书1页 说明书11页 附图3页CN 110117615 A 2019.08.13
C N 110117615
A
1.一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，所述小鼠模型为PSMD11基因杂合敲除的小鼠，其特征在于，包括步骤如下：
构建PSMD11基因条件性敲除的重组载体；线性化上述重组载体并转染胚胎干细胞；筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；将上述筛选出的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚；将含有胚胎干细胞克隆的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠；将上述杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的小鼠交配，获得PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。 2.如权利要求1所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述PSMD11基因条件性敲除的重组载体的构建方法，步骤如下：
(1)提取含有PSMD11基因的细菌人工染体；
(2)以步骤(1)提取到的细菌人工染体为模板，PCR扩增三段同源重组前段，分别为长臂、短臂、及条件性敲除区，PCR的引物序列分别为：
长臂的PCR 引物为LA -F ：5’-GGACTAGTCAATGGCTCACCACTGTCAG -3’和LA -R ：5’-CGGGATCCGAGGAGAGGGAAGAGGGAGG -3’，
短臂的PCR引物为SA -F ：5’-ACGCGTCGACAGGAACGTGAGTTACAGACG -3’和SA -R ：5’-GGAATTCCAGGAGAGCTACACAGAGAAA -3’，
条件性敲除区的PCR引物为cKO -F：5’-CGGGATCCTCTCGCAACATTGTCTTATTC -3’和cKO -R：5’-GCTCTAGAGAGTATCCAACACCCTCACA -3’，
其中，下划线为引入的酶切位点；
(3)将步骤(2)扩增得到的三段同源重组片段序贯插入质粒载体中，即得PSMD11基因条件性敲除的重组载体。
3.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述细菌人工染体为RP23-307G3和RP23-276J12。
4.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：细菌人工染体模板2μL，TaqDNA聚合酶25μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，ddH 2O21μL，共50μL；
PCR扩增的反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸3min，共30个循环；72℃保温10min。
5.如权利要求2所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述序贯插入质粒载体的方法为：采用一段同源重组片段的酶切位点对同源重组片段和质粒载体分别进行双酶切后连接，连接成功后，采用下一段同源重组片段对应的酶切位点对该同源重组片段和链接成功后的质粒载体分别进行双酶切和连接，以此类推，完成三段同源重组片段的序贯插入。
6.如权利要求1所述的一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞为C57BL/6来源的胚胎干细胞。
7.按照权利1所述的构建方法构建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型作为PSMD11基因功能研究的模型鼠的用途。
权 利 要 求 书1/1页CN 110117615 A
一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用，属于生物医学技术领域。
背景技术
[0002]条件性基因敲除小鼠模型是近年来在生命科学研究领域发展起来的一项新技术，它是在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术和同源重组技术的基础上发展起来的，通过利用Cre-loxP重组系统，可以实现条件性基因敲除，是开展基因功能研究的重要工具。[0003]PSMD11是26S蛋白酶体复合物的成分之一，该复合体负责进行ATP依赖的泛素化蛋白降解。蛋白酶体通过消除错误折叠的、受损的蛋白或者某些功能已经不再被需要的蛋白，在维持蛋白动态平衡方面发挥重要作用。因此，蛋白酶体参与细胞周期进展，细胞凋亡或者DNA损伤修复等多个过程。26S蛋白酶体包括一个20S的核心微粒(CP)，和两个19S的调控亚基(RP)。调控亚基是由一个由9个亚基(包括PSMD11蛋白)组成的盖子以及6个ATP酶和少量的附加成分组成的基底组成的。在蛋白酶体中，PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性方面都起到非常关键的作用，它的高表达或磷酸化都可以促进26S蛋白酶体的组装及活性。另外PSMD11蛋白还被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡，提示该蛋白具有多种生物学功能。为了进一步
探讨PSMD11蛋白的生物学功能，目前急需建立一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型，目前有关小鼠PSMD11基因的敲除还未见报道。
发明内容
[0004]针对现有技术的不足，本发明提供了一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法及其应用，进一步探讨PSMD11的生物学功能。
[0005]本发明的技术方案如下：
[0006]一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，所述小鼠模型为PSMD11基因杂合敲除的小鼠，其特征在于，包括步骤如下：
[0007]构建PSMD11基因条件性敲除的重组载体；线性化上述重组载体并转染胚胎干细胞；筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；将上述筛选出的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚；将含有胚胎干细胞克隆的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠；将上述杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的小鼠交配，获得PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。
[0008]根据本发明优选的，所述PSMD11基因条件性敲除的重组载体的构建方法，步骤如下：
[0009](1)提取含有PSMD11基因的细菌人工染体；
[0010](2)以步骤(1)提取到的细菌人工染体为模板，PCR扩增三段同源重组片段，分别为长臂、短臂、及条件性敲除区，PCR的引物序列分别为：
[0011]长臂的PCR引物为LA-F：5’-GGACTAGTCAATGGCTCACCACTGTCAG-3’和LA-R：5’-
CGGGATCCGAGGAGAGGGAAGAGGGAGG-3’，
[0012]短臂的PCR引物为SA-F：5’-ACGCGTCGACAGGAACGTGAGTTACAGACG-3’和SA-R：5’-GGAATTCCAGGAGAGCTACACAGAGAAA-3’，
[0013]条件性敲除区的PCR引物为cKO-F：5’-CGGGATCCTCTCGCAACATTGTCTTATTC-3’和cKO-R：5’-GCTCTAGAGAGTATCCAACACCCTCACA-3’，
[0014]其中，下划线为引入的酶切位点；
[0015](3)将步骤(2)扩增得到的三段同源重组片段序贯插入质粒载体中，即得PSMD11基因条件性敲除的重组载体。
[0016]进一步优选的，步骤(1)中所述细菌人工染体为RP23-307G3和RP23-276J12。[0017]进一步优选的，步骤(2)中所述PCR扩增的反应体系为：细菌人工染体模板2μL，TaqDNA聚合酶25μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，ddH2O21μL，共50μL；[0018]PCR扩增的反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸3min，共30个循环；72℃保温10min。
[0019]本发明中，长臂(long homology arm，LA)的片段长度为4.93kb，包括第四外显子，为第5外显子的5’同源臂；短臂(the short homology arm，SA)的片段长度为2.85kb，为第5外显子的3’同源臂；条件性敲除区(the conditional knockout region，cKO)包括第5外显子。
[0020]进一步优选的，步骤(3)中所述序贯插入质粒载体的方法为：采用一段同源重组片段的酶切位点对同源重组片段和质粒载体分别进行双酶切后连接，连接成功后，采用下一段同源重组片段对应的酶切位点对该同源重组片段和链接成功后的质粒载体分别进行双酶切和连接，以此类推，完成三段同源重组片段的序贯插入。
[0021]本发明中的质粒载体由赛业生物科技有限公司提供，三段同源重组片段序贯插入后的重组质粒载体图谱如图1中的打靶载体所示。
[0022]根据本发明优选的，所述的胚胎干细胞为C57BL/6来源的胚胎干细胞。
[0023]上述PSMD11基因条件性敲除小鼠模型作为PSMD11基因功能研究的模型鼠的用途。[0024]本发明中未详细描述的实验步骤均按照本技术领域常规操作进行。
[0025]有益效果
[0026]本发明提供了一种PSMD11基因条件性敲除小鼠模型的构建方法，通过将PSMD11基因的第5外显子敲除，从而实现失活整个基因，首次获得了PSMD11基因条件性敲除小鼠模型。PSMD11在调节蛋白酶体组装及活性方面都起到非常关键的作用，而且PSMD11蛋白还被证明能够抑制胰腺癌细胞急性凋亡，本发明构建得到的PSMD11基因条件性敲除小鼠模型为进一步研究PSMD11基因的生物学功能奠定了基础。
附图说明
[0027]图1是PSMD11基因条件性敲除重组载体的构建流程，图中，wildtype allele为野生型PSMD11基因，targetingvector为打靶载体，recombinant allele为PSMD11flox-neo基因，conditional KO allele(After Flp recombination)为与Flp小鼠杂交后的PSMD11lox基因，constitutive KO allele(After Cre recombination)为与Cre小鼠杂交后的PSMD11Δ基因；
[0028]图2是PSMD11基因条件性敲除重组载体的限制性内切酶图谱；
[0029]图3是PSMD11基因条件性敲除重组载体的单酶切验证电泳图，图中，M为DNA MAKER，1为ApaLI的酶切电泳泳道，产生的酶切条带从上到下依次为9.3、3.1、2.9、1.2、0.6、
0.1kb，2为DrdI的酶切电泳泳道，产生的酶切条带从上到下依次为4.2、3.8、3.3、2.6、1.9、
1.6kb，3为EcoRI的酶切电泳泳道，产生的酶切条带从上到下依次为9.3、6.5、1.5、0.1kb，4为FspI的酶切电泳泳道，产生的酶切条带从上到下依次为8.9、5.7、1.5、1.2kb，5为NotI的酶切电泳泳道，产生的酶切条带从上到下依次为17.3kb；
[0030]图4是重组的胚胎干细胞PCR验证电泳图，图中，左面的为区域1的PCR验证电泳图，右面的为区域2的PCR验证电泳图；
[0031]图5是重组的胚胎干细胞Southernblot验证图谱；图中，左面的为Nde I限制性内切酶酶切后的杂交结果图，右面的为HindIII限制性内切酶酶切后的杂交结果图；[0032]图6是条件性基因敲除的floxed小鼠的PCR验证电泳图，图中的泳道分别显示PSMD11lox/lox、PSMD11lox/+和野生型小鼠(PSMD11+/+)的PCR鉴定结果；
[0033]图7是PSMD11基因敲除杂合小鼠的PCR鉴定电泳图，图中，上面的是以mPSMD11-F1和mPSMD11-R1为引物的鉴定电泳图，下面的是以mPSMD11-F3和mPSMD11-R1为引物的鉴定电泳图。
具体实施方式
[0034]下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
[0035]室温：具有本领域公知的含义，一般是指25±2℃。
[0036]G418(生工生物工程(上海)股份有限公司)，是由Micromonosporarhodorangea(红橙小单孢菌)产生的一种氨基糖苷类抗生素，结构与庆大霉素B1(gentamycin B1)相似，但与庆大霉素抑制真核细胞多肽合成的机制不同，G418通过与80s核糖体不可逆性结合，从而破坏其校正阅读功能。目前，G418最重要的应用是用于选择携带neo基因的转染细胞。[0037]实施例1.PSMD11基因条件性敲除载体的构建
[0038]PSMD11基因条件性敲除载体是将PSMD11基因的第5外显子敲除，从而实现失活整个基因。首先从细菌人工染体(BAC)RP23-307G3和RP23-276J12片段中扩增3段同源重组片段，三段同源重组片段为长臂、短臂及条件性敲除区，其中长臂(long homology arm，LA)的片段长度为4.93kb，包括第四外显子，为第5外显子的5’同源臂；短臂(the short homology arm，SA)的片段长度为2.85kb，为第5外显子的3’同源臂；条件性敲除区(the conditional knockout region，cKO)包括第5外显子。应用高忠实性Taq聚合酶PCR扩增后序贯插入质粒载体，构建得到重组质粒，扩增后经测序验证后备用，其构建流程如图1所示。将重组质粒线性化后转染胚胎干细胞(ES细胞)，筛选同源重组的阳性ES克隆；最后利用显微注射技术将ES克隆注入C57BL/6小鼠囊胚，最终得到F1代PSMD11flox-neo/+小鼠，PSMD
11flox -neo/+小鼠再与Flp小鼠交配去除Neo基因，得到的PSMD11lox/+小鼠与C57Bl/6野生型小鼠回交10代，获得具有>99.9％C57Bl/6遗传背景的PSMD11lox/+小鼠。
[0039] 1.含有小鼠PSMD11基因的细菌人工染体(BAC)的提取
[0040]使用Spin Miniprep Kit提取含有PSMD11基因的BAC RP23-307G3和
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