(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010018482.9
(22)申请日 2020.01.08
(83)生物保藏信息
CGMCC No.17435 2019.03.25
CGMCC No.17197 2019.03.25
CGMCC No.17212 2019.01.18
(71)申请人 华东理工大学
地址 200237 上海市徐汇区梅陇路130号华
东理工大学生物工程学院
(72)发明人 王伟 杨海军 朱晓冲 王亚平
王晓冰 王中强
(74)专利代理机构 北京汇信合知识产权代理有
限公司 11335
代理人 张焕响
(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/14(2006.01)A01N 63/38(2020.01)A01N 63/22(2020.01)A01P 3/00(2006.01)A01P 1/00(2006.01)A01P 21/00(2006.01)C12R 1/885(2006.01)C12R 1/07(2006.01)
(54)发明名称一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用(57)摘要本发明公开了一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，包括以下步骤：将木霉菌先进行培养后，在预设间隔时间接入芽孢杆菌，进行混合发酵培养，得到微生物共生培养菌剂。还公开了该方法制备的微生物共生培养菌剂，以及该微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂、防治植物病害中的应用，可用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害，植物叶部病害。本发明改变了传统的纯培养单一菌种的发酵工艺，缓解了单一 菌种发酵所带来的能源消耗高、生产效率低的问题，并且制备的微生物共生培养菌剂缓解目前单一菌剂的生物防治和促进植物生长
效果差的问题。权利要求书1页 说明书11页 附图3页CN 111088191 A 2020.05.01
C N 111088191
A
1.一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将木霉菌先进行培养后，在预设间隔时间接入芽孢杆菌，进行混合发酵培养，得到微生物共生培养菌剂。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述预设间隔时间为20-90h。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述木霉菌为哈茨木霉菌T4，保藏编号为CGMCC No.17197；
所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌或侧孢短芽孢杆菌中至少一种，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SN16-1，保藏编号为CGMCC No.17212，所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌SN19-1，保藏编号为CGMCC No.17435。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述哈茨木霉菌接种量为1×106-1×109cfu/L；
解淀粉芽孢杆菌接种量为1×106-8×109cfu/L，所述侧孢短芽孢杆菌接种量为2×106-8×109cfu/L。
5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，混合发酵培养条件为：发酵温度为25-37℃；初始pH为5-9；通气比1:2-2:1，罐压0.03-0.05MPa；发酵总时间96-144h。
6.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，用混合发酵培养基进行混合发酵培养，所述混合发酵培养基包括以下质量浓度的组分：可溶性淀粉15-35g/L，麦麸2-10g/L，豆饼粉3-15g/L，硫酸铵0.5-3.5g/L，KH 2PO 4 0.3-1.6g/L，NaCl 0.2-
1.8g/L，CaCl 20.4-1.6g/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂。
8.根据权利要求7所述的微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，其特征在于，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害、植物叶部病害。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂、悬浮剂中的任意一种。
10.根据权利要求7所述的微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害、植物叶部病害。
权 利 要 求 书1/1页CN 111088191 A
一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及微生物共生培养技术领域，特别是涉及一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用。
背景技术
[0002]随着化学药剂的长期大量使用，病原菌的抗药性日渐突显，给环境安全和人类健康带来严重危害。因此，寻求环境友好、安全有效的病害防治方法受到广泛的关注。而利用微生物及其代谢产物控制病原菌来防治植物病害日益受到人们的关注和重视。目前国内使用的生物制剂微生物菌株单一，针对性不强，持效性和广谱性不理想。大量的研究表明，不同菌株之间可以存在良好的互惠共生关系，这种有益的共生关系可显著提高混合系统中各菌株的生长速率及代谢效率，从而在一定程度上提高某些产物的产量。
[0003]侧孢短芽孢杆菌在自然界中分布较广，在土壤、火山泥流、淡水、海水、昆虫体内、叶表、槐豆、堆肥、牛奶、奶酪、蜂蜜、淀粉类食物、胶制品工厂废水、动物皮毛和鹌鹑等材料中均已分离到。侧孢短芽孢杆菌是既能抗菌杀虫又有医用价值的微生物资源。侧孢短芽孢杆菌具有多种生物活性，且表现出广谱抗菌活性，尤其是对细菌和真菌。近期的全基因组测序结果表明，侧孢短芽孢杆菌还具有产生聚酮化合物、非核糖体肽和毒素等物质的潜力。它还能够产生氨基肽酶抑制剂、戊二酰基7-ACA酰基转移酶、凝血酶抑制剂、赖氨酸等活性物质，显示了良好的应用前景。侧孢短芽孢杆菌的抗菌性能与其产生的抗菌肽有关。针对侧孢短芽孢杆菌在杀虫活性上，国外研究较多，已有生物杀虫剂成品上市。多种侧孢短芽孢杆菌对不同的无脊椎动物如昆虫、线虫和软体动物都具有致病性。
[0004]其杀虫活性主要是由于伴孢体中所含蛋白质对多种昆虫具有毒性作用，接触或入侵靶标后，在细胞生长周期不同阶段产生不同物质，从而起到毒性作用。侧孢短芽孢杆菌菌株的芽孢中含有杀线虫
化合物，能够抑制线虫的卵孵化和幼虫发育，因此，侧孢短芽孢杆菌已成为寄生性线虫的生物防治药剂。侧孢短芽孢杆菌还具有解磷、解钾等功能。研究表明它适合开发应用于农作物的菌肥，且能在一定程度上提高土壤中有效磷的含量和农作物的产量。研究发现侧孢短芽孢杆菌能够降解水胺硫磷、降解氧化乐果、水胺硫磷等有机磷农药的作用。人们也发现越来越多的物质能被侧孢短芽孢杆菌所降解，最典型的实例是把聚乙烯醇降解为乙酸盐，还能产生多种酶如木质素过氧化酶、漆酶、氨基比林-N-脱甲基酶、NADH-DCIP还原酶和孔雀绿还原酶等。可见，侧孢短芽孢杆菌具备开发成为防治昆虫、线虫、软体动物和植物病原菌的生防菌剂的特性。同时，其解磷、解钾及其对化学农药等物质的生物降解特性，使其具有土壤生物修复的能力。
[0005]解淀粉芽孢杆菌在1943年首次分离获得，并与枯草芽孢杆菌区分开来，在1987年已经存在单独的物种并且在获批的细菌列表中出现。解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌株、好氧并能够产生孢子，常作为研究植物微生物相互作用的模式菌株，在农业上常用作生物肥料和生防菌株。解淀粉芽孢杆菌具有促进植物生长和抑制植物病原菌的潜能，如分泌不同的抗细菌和抗真菌的次级代谢物、促进植物生长和激活宿主防御系统。此外，生防菌和
病原菌对营养尤其是铁元素的竞争是植物保护的一个重要因素。解淀粉芽孢杆菌全基因组分析揭示有8.5％的基因组用于产生一些高抗菌活性的生物活性物质，如脂肽类的伊枯草菌素、抗霉素D和丰原素等，聚酮类如大环内酯、溶素、芽孢菌霉素和地非西丁等。解淀粉芽孢杆菌产生的次级代谢物能够杀
死同样从土壤中发现的一种病原细菌类鼻疽伯克氏菌。除此之外，还能够杀死类鼻疽伯克氏菌的耐药菌株，并抑制其它病原细菌如金黄酿脓葡萄球菌，大肠杆菌和鲍氏不动杆菌。解淀粉芽孢杆菌还能通过促进植物自身的生长而间接达到控制植物病害的目的。与其它生防菌株相比，解淀粉芽孢杆菌更容易培养和储存，其菌体可接种在植物种子或者是直接接种在植株体上，通过合成赤霉素(影响植物生长的多个过程，包括种子的萌发、茎干的伸长、开花期和结果期)、吲哚乙酸、胞外植酸酶(能够增强植物对矿质元素的吸收)、几丁质和抗真菌肽类等物质直接促进植物生长。发明人采用HPLC、PCR 等技术，发现解淀粉芽孢杆菌能够产生表面活性素、伊枯草菌素和丰原素，并存在合成这三种抗生素的基因。解淀粉芽孢杆菌对多种病原菌具有广谱的拮抗活性，能够促进植物的生长。
[0006]木霉菌用于防治植物病害的历史已有70多年，其生防效果已得到公认，是全世界应用较为广泛的生防菌。木霉菌属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是一类普遍存在于土壤中的真菌，是土壤微生物的重要落，其可寄生于植物残体及动物粪便上，从植物根围、叶片及种子、球茎表面也经常可以分离到，木霉菌能够寄生于多种土传植物的病原菌上。八十年代以来，随着分子生物学的快速发展，木霉菌的研究主要集中在如何提高其生物防效方面，如通过加强几丁质酶、葡聚糖酶基因的表达、种间融合等手段。大部分木霉菌对营养的需求并不严格，它们可在各种碳源和氮源下生长，同时可转化和降解一些有害或持久有害的环境污染物；可直接利用各种单糖、单糖的衍生物、有机酸类；有显著的降解各种多糖(纤维素、半纤维素)和相关的多聚糖(几丁质)；还可转化和降
解一些农药，如：、茅草枯、五氯硝基苯等。木霉菌可利用复杂和简单的氮，水解酪蛋白氨基酸混合液、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸均能很好利用，在高氮条件下有利于木霉菌产生一些酶，如纤维素酶、乳糖酶等。木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属 29种病原真菌有拮抗作用。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗对象包括丝核菌属、小核菌、核盘菌属、长蠕孢属、镰刀菌属、毛盘孢属、轮枝孢属、黑星菌属、内座壳属、腐霉属、疫霉属、间座壳属和黑星孢属等。
[0007]在长期的试验和生产实践当中，人类对微生物的发酵经历了纯种发酵和混合发酵两个阶段，发现纯种发酵使用单一的微生物，参与生化反应的酶系不多，很多重要的生化过程是单株微生物不能完成或者只能微弱进行。而混合发酵过程中不同的微生物有不同的代谢途径和代谢产物，多种微生物协同作用能优势互补、相辅相成，提高某些代谢产物的产量，节约能源，降低成本。这是单一菌株发酵无法达到的效果。而如何将多种类型的菌种进行共生培养一直是研发人员亟需解决的重要课题。
发明内容
[0008]本发明的目的是提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，改变了传统的纯培养单一菌种的发酵工艺，缓解了单一菌种发酵所带来的能源消耗高、生产效率低的问题。
[0009]本发明的目的是还提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂，缓解目前单一菌剂的生物防治和促进植物生长效果差的问题。
[0010]本发明的目的是还提供一种微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，可以制备成多种类型的制剂用于防治植物病害。
[0011]本发明的目的是还提供一种微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，可以用于防治多种植物病害。
[0012]为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0013]本发明提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，包括以下步骤：
[0014]将木霉菌先进行培养后，在预设间隔时间接入芽孢杆菌，进行混合发酵培养，得到微生物共生培养菌剂。
[0015]优选的是，所述预设间隔时间为20-90h。
[0016]优选的是，所述木霉菌为哈茨木霉菌T4，分类名哈茨木霉T r i c h o d e r m a harzianum，保藏编号：CGMCC No.17197，保藏时间：2019年03月25日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0017]所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌或侧孢短芽孢杆菌中至少一种，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SN16-1，分类名：解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号：CGMCC No.17212，保藏时间： 2019年01月18日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌SN19-1，分类名：侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，保藏编号：CGMCC No.17435，保藏时间：2019年03月25日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0018]优选的是，所述哈茨木霉菌接种量为1×106-1×109cfu/L；
[0019]解淀粉芽孢杆菌接种量为1×106-8×109cfu/L，所述侧孢短芽孢杆菌接种量为2×106-8×109cfu/L。
[0020]优选的是，混合发酵培养条件为：发酵温度为25-37℃；初始pH为5-9；通气比1:2-2:1，罐压0.03-0.05MPa；发酵总时间96-144h。
[0021]优选的是，用混合发酵培养基进行混合发酵培养，，所述混合发酵培养基包括以下质量浓度的组分：可溶性淀粉15-35g/L，麦麸2-10g/L，豆饼粉3-15g/L，硫酸铵0.5-3.5g/L，KH2PO4 0.3-1.6g/L，NaCl 0.2-1.8g/L， CaCl2 0.4-1.6g/L。
[0022]本发明还提供所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂。
[0023]本发明还提供所述的微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物枯萎病和十字花科根肿病等土传病害，稻瘟病、植物白粉病、植物灰霉病等叶部病害。
[0024]优选的是，所述制剂为水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂、悬浮剂中的任意一种。[0025]本发明还提供所述的微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物枯萎病和十字花科根肿病等土传病害，稻瘟病、植物白粉病、植物灰霉病等叶部病害。
[0026]本发明公开了以下技术效果：
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