(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911100181.4
(22)申请日 2019.11.12
(71)申请人 沭阳康源泰博生物科技有限公司
地址 223600 江苏省宿迁市沭阳县南湖街
道学院路高创园3楼沭阳康源泰博生
物科技有限公司
(72)发明人 张波 张学记 郗日沫 王鹏
刘向阳
(51)Int.Cl.
G01N 33/577(2006.01)
G01N 33/543(2006.01)
G01N 33/53(2006.01)
(54)发明名称
珠净化试剂盒
(57)摘要
本发明提供一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮
珠为载体，经过化学反应，使免疫磁珠上偶联有
黄曲霉毒素单克隆抗体和玉米赤霉烯酮单克隆
抗体。本发明可与样品中的黄曲霉毒素、玉米赤
霉烯酮实现特异性结合，利用免疫磁珠在液体中
分散更为快速均匀，减少了大量的有机溶剂的使
用，有效地减少了背景物质的干扰，缩短了免疫
反应时间，净化富集全过程控制在30分钟内，从
而能够提高检测的灵敏度，
避免漏检的现象。权利要求书1页 说明书3页CN 111426837 A 2020.07.17
C N 111426837
A
1.一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮复合免疫磁珠净化试剂盒，其以免疫磁珠为载体，经过化学反应活化，活化后磁珠与黄曲霉毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体偶联，制得能够对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体分别为：0.4mg -1mg和0.5mg -2mg。
3.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于所述的免疫磁珠浓度为5-50mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮复合免疫磁珠净化试剂盒，其特征在于使用具体步骤以下：
（1）将偶联有黄曲霉毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获15min，以实现最大程度地捕获样本中的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的样本富集净化；
（2）将步骤（1）中得到的免疫磁珠洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮样本，可用于后续测定。
权 利 要 求 书1/1页CN 111426837 A
一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮复合免疫磁珠净化试剂盒
技术领域
[0001]本发明属于一种食品安全检测分析领域，具体涉及一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免疫磁珠净化试剂盒。
背景技术
[0002]自然界中的玉米赤霉烯酮为镰刀菌属霉菌的次级代谢产物，黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次级代谢产物。该两种毒素广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物饲料及其副产品中，可以通过多种途径污染谷物、食品和饲料，直接或间接进入人类的产品食物链，可造成生殖系统的损伤，具有免疫毒性，强烈的致畸、致突变、致癌性，给人类和牲畜的健康带来了极大的危害，也给粮食工业、饲料工业和畜牧业造成经济损失。因而有效阻止黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的食品和饲料直接或间接地进入人类食物链，加强对黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的检测十分重要。
[0003]然而由于待测物基质的多样性、前处理提取技术、待测物浓度含量低等因素，现存的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的同时提取技术并不完善，不能很好地满足黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮快速检测的需求，因此研究一种高效快速地去除基质中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的方法，对于保障人类的身体安全具有重要的意义和应用价值。
发明内容
[0004]本发明目的是为了提供一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免疫磁珠净化试剂盒，用于样本中黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的复合富集和净化，以解决当前样品净化分离操作复杂、分离效率低的等技术问题。
[0005]为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免
疫磁珠净化试剂盒，其以免疫磁珠为载体，经过化学反应活化，使得磁珠表面带有亲和配基，活化后磁珠与黄曲霉毒素抗体和玉米赤霉烯酮抗体偶联，制得能够对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒，以便后续HPLC或酶联免疫吸附法的测量。
[0006]优选地，所述试剂盒的具体步骤如下（S1）：将偶联有黄曲霉毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获15min，以实现最大程度地捕获样本中的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的样本富集净化；（S2）：将步骤S1中得到的免疫磁珠洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮样本，可用于后续的HPLC测定。[0007]优选地，每个免疫磁珠净化试剂盒中所含抗黄曲霉毒素单克隆抗体、抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体分别为：0.4mg-1mg和0.5mg-2mg。
[0008]优选地，免疫磁珠浓度为10-60mg/mL。
[0009]本发明提供的一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免疫磁珠净化试剂盒具体制备方法为：
（1）抗体预处理：将已纯化好的抗黄曲霉毒素单克隆抗体及抗玉米赤霉烯酮抗体置于pH6.5 50mmol/L缓冲液透析过夜12h；
（2）活化：取一定量的磁珠于离心管中，超声分散重悬混匀，分别加入配制的EDC和NHS，在室温下放置于血液混匀仪进行活化反应2h，使溶液一直保持着悬浮混匀状态；
（3）偶联：用磁架进行磁分离，缓慢倒出上清液，同上PBS缓冲液洗涤三次，混匀仪上重悬。将已预处理好的抗黄曲霉毒素抗体及抗玉米赤霉烯酮抗体加入到已活化好的的免疫磁珠中，室温下反应过夜，放置于混匀仪上旋转保持悬浮状态；
（4）封闭：用磁架进行磁分离，倒出上清液，加入40μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液，37℃封闭2h，保持悬浮状态；
（5）保存：用PBS清洗免疫磁珠3次，磁分离，弃上清液，于4℃保存于免疫磁珠保存液中。[0010]与现有技术相比，其有益效果为：
1. 本发明利用免疫磁珠分离技术，操作简便，便于分离操作，同时也便于实现自动化，使用时不需要特殊培训的专业人员和大型的检测仪器；
2. 特异性好。本发明可在短时间迅速、有选择地分离内将样品中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的富集与纯化，净化效果比较好，避免了大量使用有机溶剂，有效地减少了背景物质的干扰，提高了后续检测的准确性和精准性。
具体实施方式
[0011]下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围，本发明具体实施方式如下。
[0012]实施例1一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免疫磁珠净化试剂盒，其以免疫磁珠为载体，经过化学反应活化，使得磁珠表面带有亲和配基，活化后磁珠与黄曲霉毒素抗体和玉米赤霉烯酮抗体偶联，制得能够对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮实现快速富集和纯化的样本前处理试剂盒，以便后续HPLC或酶联免疫吸附法的测量。
[0013]试剂盒的使用具体步骤为（1）：将偶联有黄曲霉毒素抗体、玉米赤霉烯酮抗体的免疫磁珠从冰箱中取出恢复至室温，旋转混匀，将预先处理的样本溶液放入试管中，后将免疫磁珠转移至试管中，充分旋转重悬，室温下旋转捕获15min，以实现最大程度地捕获样本中的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，利用磁架进行磁分离，缓慢弃去上清液；将已捕获过样本的免疫磁珠利用清洗液清洗数次，轻摇重悬磁分离；已实现黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的样本富集净化；（2）：将步骤1中得到的免疫磁珠洗脱液进行洗脱，室温震荡几秒钟，磁分离，上清液即为待测的黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮样本，可用于后续的HPLC测定。
[0014]实施例2本发明提供的一种黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的复合免疫磁珠净化试剂盒的具体制备方
法为：（1）抗体预处理：将已纯化好的抗黄曲霉毒素单克隆抗体及抗玉米赤霉烯酮抗体置于pH6.5 50mmol/L缓冲液透析过夜12h；（2）活化：取一定量的磁珠于离心管中，超声分散重悬混匀，分别加入配制的EDC和NHS，在室温下放置于血液混匀仪进行活化反应2h，使溶液一直保持着悬浮混匀状态；（3）偶联：用磁架进行磁分离，缓慢倒出上清液，同上PBS缓冲液洗涤三次，混匀仪上重悬。将已预处理好的抗黄曲霉毒素抗体及抗玉米赤霉烯
酮抗体加入到已活化好的的免疫磁珠中，室温下反应过夜，放置于混匀仪上旋转保持悬浮状态；（4）封闭：用磁架进行磁分离，倒出上清液，加入40μL的乙醇胺溶液和BSA封闭液，37℃封闭2h，保持悬浮状态；（5）保存：用PBS清洗免疫磁珠3次，磁分离，弃上清液，于4℃保存于免疫磁珠保存液中。
[0015]实施例3 实际样品的富集净化与检测
1、称取5.0 g的玉米样品与20mL样品稀释液（甲醇-水溶液（7:3））混合，放于震荡器震荡10分钟，离心取上清液，上清液放入样本管中；
2、将免疫磁珠试剂盒加入样品稀释液中，充分混匀后于37℃孵育20分钟，免疫作用完毕后，置于磁力架上捕获磁珠，除去上清液，用缓冲液反复清洗磁珠3次，清洗结束后以无水甲醇洗脱出免疫磁珠上的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮，所得样品即为富集纯化后的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮，留待用ELIS
A、HPLC对黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮进行含量检测，本发明可在短时间迅速、有选择地分离内将样品中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的富集与纯化，避免了大量使用有机溶剂，有效地减少了背景物质的干扰，提高了检测的准确性和精准性，利用免疫磁珠分离技术，操作简便，便于实现自动化，不需要大型仪器和特殊培训的专业人员。
[0016]以上的实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解对专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都是属于本发明的保护范围。
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