(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201480048404.6
(22)申请日 2014.09.02
13306195.2 2013.09.03 EP
14305199.3 2014.02.14 EP
C12N 9/90(2006.01)
A23L 29/30(2016.01)A23L 33/125(2016.01)C12P 19/24(2006.01)
(71)申请人罗盖特兄弟公司
地址法国莱斯特朗
(72)发明人皮埃尔·拉诺 周榴明 贾敏
张文立 江波 沐万孟 张涛
(74)专利代理机构中原信达知识产权代理有限
责任公司 11219
代理人杨青 缑正煜
(54)发明名称
其用途
(57)摘要
本发明涉及D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改
进的变体及其用途。(30)优先权数据
(85)PCT国际申请进入国家阶段日
2016.03.02
(86)PCT国际申请的申请数据
PCT/EP2014/068628 2014.09.02
(87)PCT国际申请的公布数据
WO2015/032761 EN 2015.03.12(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书2页 说明书18页序列表14页 附图6页CN 105637089 A 2016.06.01 C N 105637089
A
1.一种亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体，其中该变体包括与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比由在对应于SEQ ID No 2中位置211的位置处的丝氨酸残基对甘氨酸残基的取代；并且其中该变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。 2.根据权利要求1所述的变体，其中该变体具有一个或若干个以下特征：
a.与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更低的pH最佳值，优选地是在6至7的范围内；和/或
b.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有对底物D-果糖的更高催化效率，优选地高至少两倍；和/
或
c.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，在60℃具有更长的半衰期。
3.根据权利要求1或2所述的变体，其中该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10，优选地更优选地，与选自下组的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是选自：来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌(Ag ro ba c te ri um tum ef a cie ns)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自梭菌属(Clostridium sp)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自闪烁梭菌(Clostridium scindens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自瘤胃球菌属(Ruminococcus sp)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体，其中该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是来自解纤维梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶。
6.根据权利要求5所述的变体，其中该变体包括SEQ ID No 4的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 4具有90％或95％或更高的同一性，其中在位置211处具有残基Ser。
7.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G211S取代的SEQ ID No 5的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 5具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser。
8.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G210S取代的SEQ ID No 6的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 6具有90％或95％或更高的同一性并且在位置210处具有残基Ser。
9.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G211S取代的SEQ ID No 7的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置211处具有残基Ser。
10.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G213S取代的SEQ ID No 8的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 8具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser。
11.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G223S取代的SEQ ID No 9的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 7具有90％或95％或更高的同一性并且在位置223处具有残基Ser。
12.根据权利要求4所述的变体，其中该变体包括具有G213S取代的SEQ ID No 10的氨基酸序列或由其组成，或包括以下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQ ID No 10具有90％或95％或更高的同一性并且在位置213处具有残基Ser。
13.一种编码根据权利要求1-12中任一项所述的变体的分离的核酸。
14.一种包含根据权利要求13所述的核酸的重组表达载体。
15.一种包含根据权利要求13所述的核酸或根据权利要求14所述的重组表达载体的重组宿主细胞。
16.根据权利要求15所述的重组宿主细胞，其中将编码所述变体的核酸整合进该宿主细胞的染体中。
17.根据权利要求15-16中任一项所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是GRAS菌株(公认安全)，优选地是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
18.根据权利要求17所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是枯草芽孢杆菌菌株，其中编码杆菌肽酶F的基因是失活的。
19.一种用于产生D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体的方法，该方法包括培养根据权利要求15-18中任一项所述的重组宿主细胞，并且任选地从所得培养物回收产生的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体。 20.一种用于产生D-阿洛酮糖的方法，该方法包括在适合于D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性的条件下，使根据权利要求1至12中任一项所述的变体与D-果糖接触，并且任选地回收产生的D-阿洛酮糖。
21.如权利要求20所述的方法，其中该D-果糖是由葡糖异构酶从D-葡萄糖预先地或同时地产生的。
22.一种酶组合物，其包括根据权利要求1至12中任一项所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体和另外的酶，该另外的酶特别是葡糖异构酶。
23.根据权利要求1至12中任一项所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶变体或根据权利要求15至18中任一项所述的宿主细胞用于产生D-阿洛酮糖的用途。
24.根据权利要求17或18所述的宿主细胞用于制备食物产品的用途。
25.一种包含根据权利要求17或18所述的宿主细胞的食物产品。
D-阿洛酮糖3-差向异构酶的改进的变体及其用途
发明领域
[0001]本发明涉及用于从果糖制备阿洛酮糖的改进的异构酶，具体地是D-阿洛酮糖3-差向异构酶，及其用途。
[0002]发明背景
[0003]D-阿洛酮糖，也称为D-阿卢糖，是果糖的罕见糖异构体。它可以发现于自然界中，像在可食用蘑菇或木菠罗中，在小麦和鼠刺属植物中，但是处于非常低的浓度。
[0004]与果糖相反，人体中阿洛酮糖的代谢是被部分吸收并且以能量代谢，并且部分地在尿中和在粪便中未改变地被排出。
[0005]已经披露了D-阿洛酮糖作为用于预防生活方式相关疾病的材料的特征，包括其无热量性质，对减小升糖反应的正效应，减肥作用，等。此外，D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的甜度的约70％(大岛(Oshima)，等人(2006)不同食物产品中的阿洛酮糖含量及其来源(Psicose contents in various food products and its origin).食品科学技术研究(Food Sci Technol Res)12:137-143)，但是仅具有0.3％的蔗糖能量，并且被建议为用于食物产品的理想蔗糖代用品。它还可以用作肝脂肪生成酶和肠α-糖苷酶的抑制剂，用于减少体内脂肪累积。它进一步示出重要的生理机能，例如活性氧种类清除活性和神经保护作用。此外，在食品加工期间，它还改进了胶凝特性并且产生良好风味。
[0006]D-阿洛酮糖以极小的量存在于商业碳水化合物或农产品中，并且是难以化学合成的。因此，对于作为D-阿洛酮糖生产的有吸引力的方式，通过使用D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase)家族酶差向异构化进行D-果糖和D-阿洛酮糖之间的相互转换已经是困惑的。[0007]到目前为止，已经报道了9个类别的DTEase家族酶来源。二十年前，首先由泉森(Izumori)等人表征了DTEase，来自菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)，用D-塔格糖的最佳底物示出己酮糖的C-3差向异构化活性(泉森(Izumori)等人，1993，生物科学、生物技术和生物化学(Biosci.Biotechnol.Biochem.)57，1037-1039)。直至2006年，从根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)鉴定了具有己酮糖的C-3差向异构化活性的第二酶，并且将其命名为D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPEase)，这是由于它的针对D-阿洛酮糖的高度底物特异性(金姆(Kim)等人，2006，应用和环境微生物学(Applied and environmental microbiology)72，981-985；US 2010/0190225、WO 2011/040708)。最近，分别从类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)SK011(DTEase)(张(Zhang)等人，2009，生物技术快报(Biotechnology letters)31，857-862)、解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)H10 (DPEase)(木(Mu)等人，2011，农业与食品化学杂志(Journal of agricultural and food chemistry)，59，7785-7792，CN 102373230)、瘤胃球菌属(Ruminococcus sp)5_1_39BFAA (DPEase)(朱(Zhu)等人，2012，生物技术快报(Biotechnology letters)34，1901-1906)、鲍氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613(贾(Jia)等人，2013，应用微生物学和生物技术(Applied Microbiology and Biotechnology)DOI 10.1007/s00253-013-4924-8)、闪烁梭菌(Clostridium scindens)ATCC 35704(张(Zhang)等人，2013，公共科学图书馆杂志(PLoS ONE)8，e62987)、和梭菌属(Clostridium sp)BNL1100(木(Mu)等人，2013，生物技术
快报(Biotechnology letters)DOI 10.1007/s10529-013-1230-6)表征了另外六种DTEase 家族酶。此外，丸田(Maruta)等人披露了根瘤菌属(Rhizobium)中的产DTEase源(US 2011/ 0275138)。
[0008]只有一篇参考文献报道了通过蛋白质工程技术，对DTEase家族酶进行了酶修饰。使用随机的和定点的诱变技术，崔(Choi)等人(2011，应用和环境微生物学(Applied and environmental microbiology)77，7316-7320)构建了根癌土壤杆菌DPEase的I33L S213C 双位点变体，并且与野生型酶相比，该变体酶示出最适温度、半衰期、熔化温度、和催化效率方面的增加。它的最适pH仍在8.00保持不变。
[0009]然而，对于活性，该酶具有在8.0–9.5的最适pH，并且pH稳定性是在8.0–10.0之间，这并不适合工业应用。
[0010]因此，使用阿洛酮糖的主要关注点仍保持在其稀缺性及其生产成本，并且仍存在对改进的工业D-阿洛酮糖生产的需要。
[0011]发明概述
[0012]为了发展工业D-阿洛酮糖生产并且降低生产成本，优化的DTEase家族酶应是弱酸稳定的并且是热稳定的，并且对于底物D-果糖具有更高催化效率和转换率。
[0013]本发明涉及亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶的变体，其中该变体包括与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比由在对应于SEQ ID No 2中位置211的位置处的丝氨酸残基对甘氨酸残基的取代；并且其中该变体具有D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性。优选地，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10，更优选地，与选自下组的序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
[0014]在一个优选实施例中，该变体具有一个或若干个以下特征：
[0015] a.与该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有更低的pH最佳值，优选地是在6至7的范围内；和/或
[0016] b.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有对底物D-果糖的更高催化效率，优选地高至少两倍；和/或
[0017] c.与该亲本-阿洛酮糖3-差向异构酶相比，具有在60℃更长的半衰期。
[0018]优选地，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No2具有35％或更高的同一性，优选60％或更高的同一性，更优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性。
[0019]优选地，该变体具有以下氨基酸序列，该氨基酸序列与选自下组的序列具有60％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10，优选地更优选地，与选自下组的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高的同一性，该组由以下各项组成：SEQ ID No 2和5-10。
[0020]在一个优选实施例中，该亲本D-阿洛酮糖3-差向异构酶是选自：来自菊苣假单胞菌的D-塔格糖3-差向异构酶、来自根癌土壤杆菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自梭菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自闪烁梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自鲍氏梭菌的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、来自瘤胃球菌属的D-阿洛酮糖3-差向异构酶、和来自解纤维梭
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