(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510970347.3
(22)申请日 2015.12.22
C12N 15/63(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
A01H 5/00(2006.01)C12N 7/00(2006.01)
(71)申请人河南农业大学
地址450002 河南省郑州市金水区农业路
63号
(72)发明人康国章 刘国玉 郭天财
(74)专利代理机构河南科技通律师事务所
41123
代理人
樊羿 韩松
(54)发明名称
因研究中的应用
(57)摘要
本发明公开一种BSMV-VIGS 重组载体，为含
有目标基因片段、噬菌体f1 ori、抑制因子laci、 大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T 7
启动子的病毒RNA，所述目标基因片段为SEQ ID
NO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA 部分cDNA 序
列；其制备方法包括：TaRSR1转录因子mRNA 部
分cDNA 片段的克隆、BSMV-γ:TaRSR1重组载体
的构建、转化；本发明还公开一种病毒接种混合
液，含等体积的BSMV-α、BSMV-β、权利要求2
所述BSMV-γ: TaRSR1重组载体；以及该重组
载体在小麦增产或育种中的应用。利用本发明
BSMV-VIGS 重组载体可在田间自然条件下，建立
一种研究小麦产量性状基因功能的有效方法，有
利于深入揭示小麦产量性状基因功能的分子机
制，以指导小麦的育种工作。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书1页 说明书6页序列表2页 附图5页CN 105505963 A 2016.04.20
C N 105505963
A
1. 一种BSMV-VIGS重组载体，为含有目标基因片段、噬菌体f1 ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T 7启动子的病毒RNA，其特征在于：所述目标基因片段为SEQ ID NO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA序列。
2. 权利要求1所述BSMV-VIGS重组载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）TaRSR1转录因子mRNA部分cDNA片段的克隆
提取小麦籽粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为模板，通过PCR扩增TaRSR1转录因子片段序列，将回收所得扩增产物连接至pMD18-T simple 载体，再转化大肠杆菌DH5α，然后，挑取验证过的阳性单克隆，进行测序鉴定；
（2）BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化
取测序正确的TaRSR1-pMD18-T simple质粒与BSMV-γ: GFP质粒分别用限制性内切酶Nhe I单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSR1基因片段和BSMV-γ质粒；
用T 4-DNA连接酶将纯化后的TaRSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-γ质粒，得到BSMV-γ: TaRSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109，涂布在LB平板培养基上，LB平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PCR验证、重组质粒酶切验证和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-γ: TaRSR1重组载体。
3. 一种病毒接种混合液，含等体积的BSMV-α、BSMV-β、权利要求2所述BSMV-γ: TaRSR1重组载体。
4. 根据权利要求3所述病毒接种混合液，其特征在于：所述病毒接种混合液中各载体的浓度均为500 µg/ml。
5. 权利要求3所述病毒接种混合液的制备方法，包括以下步骤：
（1）BSMV载体线性化
用限制性内切酶Mlu I分别单酶切BSMV-α质粒和权利要求2所得BSMV-γ: TaRSR1重组质粒，使其线性化；用限制性内切酶Spe I单酶切BSMV-β质粒，使其线性化；
（2）体外转录生产病毒
取所得线性化BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ: TaRSR1载体DNA分别进行体外转录、检测和保存；
（3）病毒接种混合液的制备
取等体积的 BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ: TaRSR1，与9倍于BSMV-α体积的DEPC water和12倍于BSMV-α体积的2×GKP buffer混合均匀，即成。
6.一种研究小麦产量性状基因功能的方法，包括以下步骤：
（1）于小麦抽穗期，在田间创造一个高湿、弱光、低温的环境，用权利要求3所述病毒接种混合液摩擦小麦穗部进行接种；
（2）接种后，于小麦开花期和灌浆期保持高湿环境；同时，接种7天后对接种植株进行表型观察、目标基因的转录水平检测，成熟时进行产量性状测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述高湿环境为湿度不小于85%；所述弱光环境为4月下旬下午黄昏时分18～19点；所述低温环境为18～22℃。
8.权利要求1所述BSMV-VIGS重组载体在小麦增产或育种中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 105505963 A
BSMV-VIGS重组载体及其在小麦产量性状基因研究中的应用
技术领域
[0001]本发明属于农业应用生物技术领域，尤其涉及一种BSMV-VIGS重组载体及其在小麦产量性状基因研究中的应用。
背景技术
[0002]病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)系统是近年来发展起来研究基因功能
的新方法，它的原理主要是：当携带目标基因cDNA的病毒载体浸染植物细胞后，在植物细胞内复制与表达过程中会形成双链RNA形式的中间体（dsRNA），dsRNA作为基因沉默的激发子，首先在细胞中被特异核酸内切酶切割成小片段的RNA（siRNA），然后siRNA在植物细胞内被RNA聚合酶进一步扩增，并以单链形式与一些特异蛋白（AGO1）等结合形成RNA诱导的沉默复合体，此沉默复合体又特异与胞质中同源RNA互作，造成同源RNA降解导致产生转录后水平的基因沉默。
[0003]小麦是世界上三大重要粮食作物之一，其中普通小麦（Triticum aestivum L.）产量占全世界小麦总产90%以上。普通小麦是异源六倍体，含有A、B和D三套染体组，95%以上的基因存在3个或更多拷贝，其基因组非常庞大（17000Mb，分别是水稻和玉米基因组的40倍和7倍），而且结构复杂（85%以上序列为重复序列）；同时，由于小麦基因型的依赖性很强、品种间再生能力差异显著，导致稳定的再生体系尚未建立，成为现今世界上最难转化的作物之一。这些主要因素导致了现今小麦分子机理的研究远落后于基因组较小、转化相对容易的水稻等其它主要农作物。虽然已有一些小麦抗逆基因在拟南芥、烟草和水稻等转化较为容易的植物上进行了功能验证，但对于控制小麦籽粒淀粉、蛋白质等产量性状基因来说，由于物种间产量性状及生长环境的差异性（水稻等属于喜温的秋粮作物，生长在温度较高的夏季；而小麦属于喜凉的越冬作物，大部分时间生长在温度较低的冬季与春季），小麦产量性状基因的功能不适宜在水稻等基因组简单、转化容易的作物上进行。因此，摸索出一种适合研究小麦产量性状基因功能的研究方法，有助于深入揭示小麦产量性状形成的分子机理。
[0004]VIGS方法克服了遗传转化困难植物基因功能研究方法的局限性，主要有以下优（1）VIGS能直接在个体中鉴定基因功能缺失的表型，无需通过耗费较长的时间筛选大量点：
（2）它是一种瞬时基因沉默方法，再生植株个体来鉴定转基因植株，可快速鉴定基因功能；
（3）能通过对基因家族中高度保守的序列进行沉默来克服基不需要复杂的遗传转化体系；
（4）可快速比较同一基因在不同物种中的功能，以进行比较基因组学研因功能冗余现象；
究。上述优点对于遗传转化困难、且基因组庞大而复杂的普通小麦来说，非常适用，因此，VIGS已在小麦基因功能研究上开始应用。
[0005]但现今国内外运用VIGS方法研究小麦基因的功能均在实验室培养箱内或温室内等易控条件下（人工可设定的温度、湿度、光照等可控的生长条件）进行小麦抗逆基因的功能研究。但培养箱或温室可控条件下与田间多变条件下的小麦植株的生长状况有一定差异。如培养箱或温室中小麦植株生长发育表现出分蘖率较差、生育期缩短、生育后期植株早
衰、千粒重较低、产量显著低于田间生长的小麦植株等现象，导致在培养箱或温室环境下利用VIGS方法研究小麦基因功能、特别是产量性状基因的功能有一定局限性。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种BSMV-VIGS重组载体，利用该载体可在田间自然条件下，建立一种研究小麦产量性状基因功能的有效方法，有利于深入揭示小麦产量性状基因功能的分子机制，以指导小麦的育种工作。
[0007]本发明的研究思路为：利用大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus, BSMV）重组构建含有α、β 和 γ三条不同的单链 RNA的BSMV载体系统（如图1所示）。分别将上述三条链的RNA反转录合成cDNA后，克隆到对应的pBSMV载体上。该载体包含有T7启动子和转录原点，可通过 T7 RNA 聚合酶以线性化BSMV载体为模板体外进行转录，获得病毒RNA，用转录得到的3条链的RNA转录本等量摩擦接种植物后，病毒 RNA 在植物体内能形成具有活性的基因组，进行增殖传播。在γb之后有一个NheI酶切位点，可将目标基因片段通过分子克隆构建到BSMV-γ载体上，目标基因片段可以随着病毒自身基因组的复制而得到复制，并通过转录后水平沉默目标基因。
[0008]为完成上述目的，本发明采用以下技术方案来实现的：
构建了一种BSMV-γ:TaRSR1重组载体，其为含有目标基因片段、噬菌体f1 ori、抑制因子laci、大肠杆菌E1因子ori、β-内酰胺酶基因bla、T7启动子的病毒RNA，所述目标基因片段为SEQ ID NO.1所示的TaRSR1转录因子mRNA 部分cDNA序列。
[0009]上述重组载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）TaRSR1转录因子mRNA 部分cDNA片段的克隆
提取小麦籽粒的总RNA，并通过反转录获得与小麦总RNA对应的cDNA，取所得cDNA作为模板，通过PCR扩增TaRSR1转录因子片段序列，用所得扩增产物进行电泳检测、切胶回收，将回收所得扩增产物连接至pMD18-T simple载体，再转化大肠杆菌DH5α，然后，挑取验证过的阳性单克隆，进行测序鉴定；
（2）BSMV-γ:TaRSR1重组载体的构建、转化与筛选
取测序正确的TaRSR1-pMD18-T simple质粒与BSMV-γ: GFP质粒分别用限制性内切酶Nhe I单酶切，再进行电泳检测、切胶回收，分别得到纯化的TaRSR1基因片段和BSMV-γ质粒；
用T4-DNA连接酶将纯化后的TaRSR1基因片段连接至纯化后的BSMV-γ质粒，得到BSMV-γ: TaRSR1重组载体，再将其转化至感受态大肠杆菌JM109，涂布在LB平板培养基上，LB平板培养基经37℃过夜培养长出单菌落，将所得单菌落依次进行PCR验证、重组质粒酶切验证和测序鉴定，挑选阳性菌落，得BSMV-γ: TaRSR1重组载体。
[0010]由等体积的BSMV-α、BSMV-β、及上述BSMV-γ: TaRSR1，加入DEPC water和2×GKP buffer等混合均匀后，制成各载体浓度为500 µg/ml的病毒接种混合液，可用小麦产量性状基因功能的研究，用于指导小麦育种工作，也可直接将其用于小麦增产。
[0011]上述病毒接种混合液的制备方法，包括以下步骤：
（1）BSMV载体线性化
用限制性内切酶Mlu I分别单酶切BSMV-α质粒和权利要求2所得BSMV-γ: TaRSR1重组
质粒，使其线性化；用限制性内切酶Spe I单酶切BSMV-β质粒，使其线性化；
（2）体外转录生产病毒
取所得线性化BSMV-α、BSMV-β和BSMV-γ: TaRSR1载体DNA分别进行体外转录、检测和保存；
（3）病毒接种混合液的制备
取等体积的 BSMV-α、BSMV-β、BSMV-γ: TaRSR1，与9倍于BSMV-α体积的DEPC water和12倍于BSMV-α体积的2×GKP buffer混合均匀，即成。
[0012]田间自然条件下研究小麦产量性状基因功能的方法，包括以下步骤：于小麦抽穗期，在田间创造一个高湿（湿度85%以上）、黄昏弱光、18～22℃低温的环境，用上述BSMV-VIGS沉默载体病毒接种混合液摩擦小麦穗部进行接种；接种后，于小麦开花期和灌浆期保持高湿环境（小麦植株用薄膜
拱棚覆盖，处于相对封闭的空间，湿度达85%以上）；同时，接种7天后对接种植株进行表型观察、目标基因的转录水平检测，成熟时进行产量性状测定。
[0013]本发明具有以下积极有益技术效果：
1.本发明重组载体实现了田间条件下小麦产量性状基因的沉默，改变了目前小麦产量性状基因功能研究较为困难的局面，打破了传统VIGS方法主要在实验室内应用的现状；该重组载体可快速进行作物基因功能分析，操作简单且效果显著（接种成功率达50%以上），且田间VIGS沉默有效持续时间（35 d左右）涵盖了籽粒的灌浆阶段，有效持续时间长于现今温室内VIGS有效持续时间（28 d左右）。
[0014] 2.本发明在田间进行小麦产量性状基因功能的试验，结果能更真实反映出基因在产量性状中的功能。
[0015] 3.根据本发明中的实验方法以及农业领域研究人员所具备的实验技能，本领域研究人员可将本发明的方法应用到小麦同源性较高的物种上，诸如大麦、谷子、水稻、高粱、玉米等，这些应用范围均在本发明请求保护范围内。
附图说明
[0016]图1为 BSMV载体的主要结构示意图；
图2为TaRSR1转录因子的表达量与淀粉合成相关基因表达量的相关性对比图；
注：图中TaAGPS1-a，TaAGPL1，TaGBSSI，TaSSI，TaSSIIa，TaSSIV，TaBEI，TaBEIIb，TaPUL，TaPHOL和TaDPE1均为淀粉合成相关酶基因；
图3为构建的重组质粒BSMV-γ: TaRSR1的结构示意图；
注：图中ori 是大肠杆菌E1因子，laci 是抑制因子，f1 ori 是噬菌体，bla 是β-内酰胺酶基因，T7 是启动子，NheI是酶切位点，TaRSR1是目的基因；
图4为重组质粒BSMV-γ: TaRSR1酶切电泳图谱；
注：M. DL 2000 marker；泳道1、3和5为BSMV-γ: TaRSR1重组质粒；泳道2、4和6为BSMV-γ: TaRSR1重组质粒酶切出目的片段；
图5为体外转录生产BSMV病毒产物的电泳图谱；
注：M. DL 10,000 marker；泳道1-4分别是BSMV-α、BSMV-β、 BSMV-γ: TaRSR1、BSMV-γ:GFP；
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