(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710141425.8
(22)申请日 2017.03.10
(71)申请人 江苏金斯瑞生物科技有限公司
地址 212114 江苏省镇江市新区丁卯经15
路99号30号楼
(72)发明人 王卫国 章方良 庆辉
(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任
公司 32218
代理人 傅婷婷 夏平
(51)Int.Cl.
G01N 21/78(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种检测残留的方法，包
胺洗涤树脂，过滤，收集洗涤液，向洗涤液中加入
四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液和乙醛的二甲基
甲酰胺溶液，反应一段时间后，观察溶液颜；如
果溶液颜为四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液的
颜，表明洗涤完全，未残留；否则，表明哌
啶残留。本发明适合简便、高效地检测残留，
解决了洗涤次数不明确的问题。权利要求书1页 说明书3页CN 108572171 A 2018.09.25
C N 108572171
A
1.一种检测Fmoc固相多肽合成中Fmoc保护基脱除后树脂中残留的方法，其特征在于：包括向脱除Fmoc保护基的树脂中加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，收集洗涤液，向洗涤液中加入四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液和乙醛的二甲基甲酰胺溶液，反应一段时间后，观察溶液颜；如果溶液颜为四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液的颜，表明洗涤完全，未残留；否则，表明残留。 2.根据权利要求1所述的检测残留的方法，其特征在于：脱除Fmoc保护基的树脂通过以下方法获得：在芴甲氧羰酰基-氨基酸或肽-树脂复合物中，加入含的二甲基甲酰胺溶液或，反应20min后，过滤。
3.根据权利要求2所述的检测残留的方法，其特征在于：所述的含的二甲基甲酰胺溶液中的体积百分含量为5％以上。
4.根据权利要求2所述的检测残留的方法，其特征在于：芴甲氧羰酰基-氨基酸或肽-树脂复合物与/二甲基甲酰胺溶液的质量体积比为1：5～10。
5.根据权利要求1或2所述的检测残留的方法，其特征在于：芴甲氧羰酰基-氨基酸(或肽)-树脂复合物与二甲基甲酰胺的质量体积比为1：5～10。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液中四氯苯醌与二甲基甲酰胺的质量体积百分含量为2～10％。
7.根据权利要求1或2所述的检测残留的方法，其特征在于：所述的乙醛的二甲基甲酰胺溶液中乙醛与二甲基甲酰胺的质量体积百分含量为2～10％。
8.根据权利要求1或2所述的检测残留的方法，其特征在于：所述的洗涤液、试剂A 及试剂B之间的体积比例关系为1：1～5：1～5；所述的反应时间为1～10min。
权 利 要 求 书1/1页CN 108572171 A
一种检测残留的方法
技术领域
[0001]本发明属多肽化学领域，特别涉及一种检测残留的方法。
背景技术
[0002]多肽合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽合成可以验证新的多肽结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽药物等。1963年，R.B.Merrifield创立了将多肽羧基端的氨基酸固定在不溶性树脂上，然后在此树脂上依次偶联氨基酸，延长肽链、合成多肽的固相合成法，在固相法中，每步
反应后只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的。克服了经典液相合成法中的每一步产物都需纯化的困难，为多肽的自动化合成奠定了基础。为此，Merrifield获得1984年诺贝尔化学奖。
[0003]Merrifield所建立的Boc合成法是采用TFA(三氟乙酸)可脱除的Boc(叔丁氧羰基)为α-氨基保护基，侧链保护采用苄醇类。合成时将一个Boc－氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA脱除Boc，用三乙胺中和游离的氨基末端，然后通过DCC活化、偶联下一个氨基酸，最终脱保护多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法。用Boc法已成功地合成了许多生物大分子，如活性酶、生长因子、人工蛋白等。
[0004]在Boc合成法中，反复地用酸来脱保护，这种处理带来了一些问题：如在肽与树脂的接头处，当每次用50％TFA脱Boc基时，有约1.4％的肽从树脂上脱落，合成的肽链越长，这样的损失越严重；此外，酸处理会引起侧链的一些副反应，Boc合成法尤其不适于合成含有氨酸等对酸不稳定的肽类。1978年，Chang、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino报道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团作为α-氨基保护基，成功地进行了多肽的Fmoc固相合成。Fmoc 法与Boc法的根本区别在于采用了碱可脱除的Fmoc为α-氨基的保护基，侧链的保护采用TFA 可脱除的叔丁氧基等，树脂采用90％TFA可切除的对烷氧苄醇型树脂，最终的脱保护避免了强酸处理。
[0005]由于反应条件温和，Fmoc固相多肽合成策略现已经成为固相多肽合成领域中的主要方法。Fmo
c保护基可以用迅速脱除。的残留会导致下一步缩合反应中的氨基酸上的Fmoc保护基被过早脱除，导致副反应的发生。因此，如何灵敏地检测的残留对于提高多肽合成效率意义重大。目前尚未见这方面的报道。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种简便、高效的残留的检测方法，解决洗涤次数不明确的问题。
[0007]本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008]一种检测Fmoc固相多肽合成中Fmoc保护基脱除后树脂中残留的方法，包括向脱除Fmoc保护基的树脂中加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，收集洗涤液，向洗涤液中加入四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液和乙醛的二甲基甲酰胺溶液，反应一段时间后，观察溶液颜
；如果溶液颜为四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液的颜，表明洗涤完全，未残留；否则，表明残留。
[0009]其中，所述的脱除Fmoc保护基的树脂通过以下方法获得：在芴甲氧羰酰基-氨基酸(或肽)-树脂复合物中，加入含的二甲基甲酰胺溶液或，反应20min后，过滤。[0010]所述的含的二甲基
甲酰胺溶液中体积百分含量优选5％以上。芴甲氧羰酰基-氨基酸(或肽)-树脂复合物与所述的/二甲基甲酰胺溶液的质量体积比优选1g：5～10mL。
[0011]所述的芴甲氧羰酰基-氨基酸(或肽)-树脂复合物与二甲基甲酰胺的质量体积比优选1g：5～10mL。
[0012]所述的四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液中四氯苯醌与二甲基甲酰胺的质量体积百分含量优选2～10％。
[0013]所述的乙醛的二甲基甲酰胺溶液中乙醛与二甲基甲酰胺的质量体积百分含量优选2～10％。
[0014]所述的洗涤液、试剂A及试剂B之间的体积比例关系优选1：1～5：1～5；所述的反应时间优选1～10min。
[0015]本发明的有益效果是：本发明提供了一种简便、高效的残留的检测方法，能可视化的检测残留，解决洗涤次数不明确的问题。
具体实施方式
[0016]本发明通过以下实例作进一步举例说明，这些实例不应解释为对本发明的限制。[0017]实施例1：
[0018](1)配制试剂A。
[0019]配制质量体积比为2％四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液。
[0020](2)配制试剂B。
[0021]配制体积比为2％乙醛的二甲基甲酰胺溶液。
[0022](3)制备洗涤液。
[0023]在1g Fmoc-Ala-Rink amide Am树脂复合物中，加入5ml体积比为5％的PIP/DMF溶液，反应20min后，过滤。加入5ml DMF洗涤树脂，过滤，收集洗涤液。
[0024](4)验。
[0025]取1滴洗涤液，加入试剂A和B各1滴，反应1min后，观察溶液颜为蓝，非试剂A的颜，表明洗涤不完全，有残留。重复洗涤树脂留和验的步骤，直至洗涤液呈现试剂A 的颜。
[0026]实施例2：
[0027](1)配制试剂A。
[0028]配制质量体积比为5％四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液。
[0029](2)配制试剂B。
[0030]配制体积比为5％乙醛的二甲基甲酰胺溶液。
[0031](3)制备洗涤液。
[0032]在1g Fmoc-Ala-Ala-Ala-Rink amide Am树脂复合物中，加入7ml体积比为20％的
PIP/DMF溶液，反应20min后，过滤。加入7ml DMF洗涤树脂，过滤，收集洗涤液。
[0033](4)验。
[0034]取1滴洗涤液，加入试剂A和B各3滴，反应5min后，观察溶液颜为蓝，非试剂A的颜，表明洗涤不完全，有残留。重复洗涤树脂留和验的步骤，直至洗涤液呈现试剂A 的颜。
[0035]实施例3：
[0036](1)配制试剂A。
[0037]配制质量体积比为10％四氯苯醌的二甲基甲酰胺溶液。
[0038](2)配制试剂B。
[0039]配制体积比为10％乙醛的二甲基甲酰胺溶液。
[0040](3)制备洗涤液。
[0041]在1g Fmoc-Ala-2-氯树脂复合物中，加入10ml体积比为100％的PIP，反应20min 后，过滤。加入10ml DMF洗涤树脂，过滤，收集洗涤液。
[0042](4)验。
[0043]取1滴洗涤液，加入试剂A和B各5滴，反应10min后，观察溶液颜为蓝，非试剂A 的颜，表明洗涤不完全，有残留。重复洗涤树脂留和验的步骤，直至洗涤液呈现试剂A的颜。
[0044]本发明中一些常用的缩写具有如下含义：
[0045]Fmoc：芴甲氧羰酰基
[0046]DMF：N,N-二甲基甲酰胺
[0047]PIP：
[0048]Chloranil：四氯苯醌
[0049]Ethanol：乙醛
[0050]Ala：丙氨酸。
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