(10)申请公布号 CN 102899378 A
(43)申请公布日 2013.01.30C N 102899378 A
*CN102899378A*
(21)申请号 201210395805.1
(22)申请日 2012.10.18
C12P 33/00(2006.01)
C12P 17/06(2006.01)
C12R 1/645(2006.01)
(71)申请人昆明理工大学
地址650093 云南省昆明市五华区学府路
253号
(72)发明人葛锋 武阳阳 王艳 刘迪秋
陈朝银
(54)发明名称
红曲霉对三七药材进行生物转化的方法
(57)摘要
本发明公开了一种红曲霉对三七药材进行生
物转化的方法，该方法操作步骤主要包括：（1）红
曲霉（Monascuspurpureus ）菌种的制备；（2）三七
使用本发明所提出的红曲霉发酵三七的方法，直
接以三七原药材作为发酵底物，通过一次发酵过
程同时获得三七和红曲霉药用成分，使培养物兼
具三七和红曲的双重功效，实验显示产物中含有
出现了明显变化，产生了更具药理活性的稀有皂
苷。
(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书5页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 5 页
1/1页
1.一种红曲霉对三七药材进行生物转化的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
（1）将生产菌株为红曲霉接种到PPDA 斜面培养基中，于30℃恒温培养，至长出菌落；
（2）按1 g 粒度为80-100目的三七粉加入6-8 mL 水的比例配制三七粉的水悬液，121℃灭菌30 min ，即得三七培养基，备用；
（3）将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）配制的三七培养基中，于15-35℃下，120 r/min 摇床培养2-7 d ，即得到含有活性成分的发酵产物。
2.根据权利要求1所述红曲霉对三七药材进行生物转化的方法，其特征在于：对含有活性成分的发酵产物进行抽滤，滤渣用纯水清洗2次，合并滤液，滤液4000 r/min 离心30 min ，上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h ，静置分层后，收集上层正丁醇相60-70 ℃旋蒸至干燥，即得含皂苷活性成分的产物；滤渣菌丝体在60-70℃烘干至恒重，按每克菌丝体添加10-15 mL 甲醇的比例加入甲醇，超声提取30 min ，然后用0.24 µm 滤膜过滤，即得含洛伐他汀的滤液。权 利 要 求 书CN 102899378 A
红曲霉对三七药材进行生物转化的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种红曲霉对三七药材进行生物转化的方法，通过该方法可以获得含有活性成分的产物。
背景技术
[0002] 三七[Panax notoginseng(Burk.) F. H. Chen]为五加科人参属植物，主产于云南，主要活性成分为三七总皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)。目前为止，已从三七中分离出70余种人参皂苷，均属达玛烷型四环三萜皂苷。按其皂苷元类型又可细分为两类：20(S)-原人参二醇型[20(S)-protopanaxadiol]和20(S)-原人参三醇型[20(S)-protopanaxatriol]。其中原人参二醇型皂苷包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3、Rb3、C-K、PPD；原人参三醇型皂苷包括Rg1、Rg2、Re、R1、Rh1、F1、PPT。天然皂苷中含量较高的是Rg1、Rb1、Rd、R1、Rc、Re；含量甚微或不含的稀有皂苷为Rd、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、F1、F2、PPD、PPT、C-K。稀有皂苷在心脑血管疾病、抗肿瘤方面表现出较好的药理活性，如人参皂苷Rd对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特，有可能成为脑卒中的新型临床药物。人参皂苷Rd在植物中含量少，化学合成至今尚未成功，目前仅能从原植物的根、茎、叶中提取，效率低，成本高。
[0003] 三七总皂苷在胃肠道中吸收较差，皂苷在胃液作用下只发生轻微的水解反应，代谢产物在肠液中酶或菌的作用下，糖苷键逐步断裂，降解成稀有皂苷才真正发挥药理作用，这个不但增加了胃肠负担，而且降低了生物利用度。稀有皂苷在三七药材中不含或含量甚微，可在体外通过生物法由三七总皂苷转化获得，并因其效率高、无污染，而具有较好的应用前景。
[0004] 红曲霉（Monascus purpureus）是一种药用真菌，红曲霉的发酵产物中含有洛伐他汀、豆甾醇等具有降脂活性的化合物。目前，以红曲霉发酵物为主要成分的药品因效果显著，安全无副作用，可长期服用的特点，占据了中药降血脂药物的最大市场份额。
[0005] 三七的主要功效在于预防和脑中风，而红曲霉培养物主要用于预防和高血脂和高胆固醇血症，它们二者都是防治心脑血管疾病的特效药，但在适应症方面却各具特。为了达到全面防治心脑血管疾病的目的，常常同时服用三七和红曲，但胃肠对有效成分的吸收、转化和利用率不高。本发明以三七药材为发酵培养基成分，直接用红曲霉（Monascus purpureus）对三七药材进行生物转化，同时获得药用稀有人参皂苷、洛伐他汀等活性成分。发酵过程中产生了原药材中未检测到，但能直接吸收和利用的活性物质，提高了药物的生物利用度，发酵培养物兼具三七和红曲药效，有可能成为用于防治心脑血管疾病的新型候选药物。以上发明内容未见国内外相关研究报道。
发明内容
[0006] 本发明提供了一种红曲霉对三七药材进行生物转化获得活性成分的方法，该方法利用药用真菌红曲霉（Monascus purpureus）发酵三七药材，同时获得真菌和三七药用
活性成分。
[0007] 该方法的操作步骤如下：
（1）菌种制备：将红曲霉（Monascus purpureus）接种到PPDA斜面培养基，于30 ℃恒温培养，至长出菌落；
（2）按1 g粒度为80-100目的三七粉加入6-8 mL水的比例配制三七粉的水悬液，121℃灭菌30 min，即得三七培养基，备用；
（3）将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）配制的三七培养基中，于15-35 ℃下，120 r/min摇床培养2-7 d，即得到含有活性成分的发酵产物，该产物可用于制备防治心脑血管疾病的药物。
[0008] 本发明中液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用纯水清洗滤渣2次，合并滤液，4000 r/min下离心30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相60-70℃旋蒸至干燥，即得含皂苷活性成分的固体；滤渣菌丝体在60-70 ℃烘干至恒重，按每克菌丝体添加10-15 mL甲醇的比例加入甲醇，超声提取30 min，然后用0.24 µm滤膜过滤，
即得含洛伐他汀的滤液。
[0009] 本发明的关键点在于：使用药用真菌对植物药材进行生物转化，通过一次发酵过程同时获得红曲和三七药效成分，且三七药用皂苷成分与原药材相比，主要皂苷的含量出现了明显变化，同时产生了要药材中未检测到，但更具药理活性的稀有皂苷成分。由于生物转化作用，提高了药材的生物利用度，降低了药物的胃肠反应和副作用。本发明表明，发酵产物具有全面防治心脑血管疾病的红曲和三七药用成分。通过控制发酵条件，可以重构药用成分种类和含量，进而实现定向改变和调整药效的人为干预。
[0010]
具体实施方式
[0011] 以下通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
[0012] 实施例1：红曲霉对三七药材进行生物转化的方法，具体操作如下：（1）菌种制备：将红曲霉（Monascus purpureus）接种到PPDA斜面培养基，于30 ℃恒温培养3 d，至长出菌落；红曲霉菌种从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得（CGMCC 3.991）；
（2）三七培养基：精确称取3 g过80目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入20 mL水，自然pH，121 ℃
灭菌30 min，即得三七培养基，备用；
（3）液体发酵培养：将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）制备的三七培养基中，分别于15和35 ℃，120 r/min培养4 d，即得到含有活性成分的发酵产物；
（4）液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣2次，合并滤液，离心（4000 r/min）30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相旋蒸（60 ℃）至干燥，即得含皂苷活性成分的产物，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC检测培养物中的皂苷成分；滤渣菌丝体在60℃烘干至恒重，按每克菌丝体添加12 mL甲醇的比例加入25 mL甲醇，超声提取30 min，然后用0.24 µm滤膜过滤，用HPLC检测滤液中洛伐他汀含量。见表1。
[0013] 表1：不同培养温度对发酵产物有效成分种类和含量的影响
以上实验结果表明：红曲霉发酵三七得到的产物除含有原药材中的各种皂苷成分外，还合成了原药材中没有，却可被人体直接吸收和利用的稀有皂苷药用成分。同时，培养物中含有降血脂、降胆固醇功
效的洛伐他汀，充分体现了红曲的药用功效。因此，发酵产物除兼具三七和红曲的药效外，还因稀有皂苷的合成而改善了药用成分的生物利用度。
[0014]
实施例2：红曲霉对三七药材进行生物转化的方法，具体操作如下：
（1）菌种制备：将红曲霉（Monascus purpureus）接种到PPDA斜面培养基，于30 ℃恒温培养，至长出菌落；红曲霉菌种从中国普通微生物菌种保藏管理中心获得（CGMCC），保藏号：3.991；
（2）三七培养基：精确称取3 g过90目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入24 mL水，自然pH，121℃灭菌30 min；
（3）液体发酵培养：将步骤（1）中制备好的菌种接入步骤（2）制备的三七培养基中，于30℃，120 r/min培养2 d和7 d，即得到含有活性成分的发酵产物；
（4）液体发酵物后处理：将步骤（3）中培养好的液体发酵物抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣2次，合并滤液，离心（4000 r/min）30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相旋蒸（70 ℃）至干燥，即得含皂苷活性成分的产物，用5 mL70%甲醇溶解残渣，采用HPLC检测培养物中的皂苷成分；滤渣菌丝体在70 ℃烘干至恒重，按每克菌丝体添加10 mL甲醇的比
例加入22 mL甲醇，超声提取30 min，然后用0.24
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