(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910200128.5
(22)申请日 2019.03.15
(71)申请人 李文杰
地址 063000 河北省唐山市路北区祥云西
里17楼3门202号
(72)发明人 李文杰 连素梅 娄巧哲 靳慧达
郝凌云
(51)Int.Cl.
C12Q 1/18(2006.01)
C12Q 1/06(2006.01)
C12N 1/20(2006.01)
C12R 1/42(2006.01)
C12R 1/19(2006.01)
C12R 1/445(2006.01)
C12R 1/01(2006.01)
(54)发明名称ATP荧光lgC A -lgI A 标曲法检测抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能的方法(57)摘要本发明涉及一种抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能检测方法，检测步骤包括：样品制备及前处理；设备选型及试剂、培养基配制；菌种保藏、活化及菌悬液制备；ATP浓度对数值lgC A -相对荧光强度对数值lgI A 标曲建立及接种菌液活菌ATP浓度C A 标定；样品接种、培养及洗脱回收；回收液I A 测定及其活菌ATP浓度C A 和T A 推算；抗菌率R或抗菌活性值A计算；结果评价；其特别之处在于：应用ATP荧光光度计对以R或A表征的合成革抗细菌性能进行精准定量测试。本发明规定洗脱回收接触0h及培养24h后的对照样品和抗菌样品，测定回收液I A 并以lgI A 表征和计算R或A；提供结果评价依据。本发明研发的抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能检测的ATP生物荧光lgC A -lgI A 标曲法，将以 先进检测技术支撑产品质量提升。权利要求书9页 说明书22页CN 110272966 A 2019.09.24
C N 110272966
A
权 利 要 求 书1/9页CN 110272966 A
1.一种抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能的检测方法，包括：(1)样品制备及前处理；(2)设备选型及试剂、
培养基配制；(3)菌种保藏、活化及菌悬液制备；(4)ATP浓度对数值lgC A-相对荧光强度对数值lgI A标准曲线建立及接种菌液活菌ATP浓度C A标定；(5)样品接种、培养及洗脱回收；(6)回收液相对荧光强度值I A测定；(7)回收液的活菌ATP浓度C A和T A推算以及抗菌率R和抗菌活性值A计算；(8)结果评价；其特征在于，应用ATP荧光光度计对以抗菌率R或抗菌活性值A表征的抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能进行精准定量测试的ATP生物荧光lgC A-lgI A标准曲线法，具体的： 在回收液相对荧光强度值I A测定中：
明确对照样品和抗菌样品的数量、尺寸及前处理要求，将试验标准菌株进行传代、活化后，取连续转接2次的新鲜细菌培养物制备菌悬液并对其菌数进行初筛，用试验菌种培养液将1.0×10-3mol/L的ATP标准原液稀释为高、低浓度标准系列溶液：7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L、7.0×10-7mol/L(如果仪器检测上限无法达到10-7mol/L量级或高浓度标准曲线的线性较差，可将其ATP浓度系列改为7.0×10-10mol/L、7.0×10-9mol/L、7.0×10-8mol/L)和3.5×10-11mol/L、3.5×10-10mol/L、3.5×10-9mol/L，并测定其相对荧光强度值I A；绘制两条相应浓度的lgC A-lgI A标准曲线，推导得出曲线方程式Y＝a A0X+b A0(高浓度)、Y＝a A X+b A(低浓度)和线性相关系数R A02(高浓度)、R A2(低浓度)，对细菌总量为6.0×108CFU/mL的菌悬液进行10倍梯度稀释后，测定其相对荧光强度值I A，根据高浓度标准曲线方程式Y＝a A0X+b A0推算相应的活菌ATP浓度C A；经调整得到C A范围为5.0×10-8mol/L～9.0×10-8mol/L的接种菌液，然后，将1mL接种菌液分别滴加到各组对照样品和抗菌样品上，立即采用19mL试
验菌种培养液对6组0h接触样品进行(24±1)℃、1min±5s、250r/min～300r/min的振荡洗脱，应用ATP荧光光度计测定回收液的相对荧光强度值I AC0ij、I AT0ij，根据低浓度标准曲线方程式Y＝a A X+b A推算其活菌的ATP浓度C AOij和T AOij，同时，将另外6组样品于(37±1)℃静置培养24h±2h后，采用与0h接触样品相同的方式进行洗脱回收，并应用ATP荧光光度计测定其回收液的相对荧光强度值I ACtij、I ATtij，推算相应的活菌ATP浓度C Atij和T Atij；
在抗菌率R及抗菌活性值A计算中：
根据ATP低浓度标准曲线lgC A-lgI A的线性方程式Y＝a A X+b A，以0h接触及经24h静置培养Array
后每件对照样品和抗菌样品回收液的相对荧光强度测定值和作为基础数据；在试验有效条件下，计算其抗菌率R ij和抗菌活性值A ij；对每组样品的R ij和A ij取算术平均值得到相应的R i和A i；每批抗菌聚氨酯合成革样品的抗菌率R和抗菌活性值A为其三组样品R i和A i的算术平均值；并明确相关数据修约和测量不确定度要求；
在结果评价中：
参考卫生行业通用做法和相关抗菌产品标准要求，确定抗细菌性能分级判定标准；当某组(件)抗菌聚氨酯合成革样品的抗菌率R i(R ij)或抗菌活性值A i(A ij)与其他两组(四件)样品的抗细菌性能相比至少相差
一个水平级时，重新提取一组(件)样品重复实验；计算其经ATP生物荧光lgC A─lgI A标准曲线法测得的抗菌率或抗菌活性值，如果前后两组(件)抗菌聚氨酯合成革样品抗细菌性能水平相同，则弃之；取另外两组(四件)剩余样品抗菌率R i (R ij)或抗菌活性值A i(A ij)的算术平均值作为该批次(组)抗菌聚氨酯合成革样品抗细菌性能的评价结果。
2.根据权利要求1所述的抗菌聚氨酯合成革抗细菌性能的检测方法，其特征在于，所述
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