(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911281742.5
(22)申请日 2019.12.13
(71)申请人 南京农业大学
地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇
国家农业科技园南京农业大学基地
(72)发明人 郭旺珍 王海棠 周雪松
(74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任
公司 32218
代理人 徐冬涛 李晓峰
(51)Int.Cl.
C12N 15/56(2006.01)
C12N 9/24(2006.01)
C12N 15/82(2006.01)
C12N 5/10(2006.01)
A01H 5/00(2018.01)
A01H 6/60(2018.01) (54)发明名称
中的应用
(57)摘要
本发明公开一种棉花GhGlu19基因及其在提
高棉花产量中的应用，属于生物技术应用领域。
本发明涉及的GhGlu19基因，其编码一个β-1,3-
葡聚糖酶。本发明提供了GhGlu19在异源四倍体
陆地棉遗传标准系TM -1中的基因组A亚组、D亚组
中全长ORF核苷酸序列和氨基酸序列。以此基因
花材料，结果表明抑制该基因表达可以显著增加
铃重、每铃种子数和单株有效铃数，提高衣分，增
强种子活力等，
进而显著提高棉花产量。权利要求书1页 说明书10页序列表5页 附图6页CN 110904131 A 2020.03.24
C N 110904131
A
1.棉花GhGLU19基因在提高棉花产量或培育棉花新种质中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过抑制棉花GhGLU19基因的表达量提高棉花产量。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的棉花GhGLU19基因为(1)～(3)中的任意一种：
(1)该基因在陆地棉TM -1A亚组(GhGLU19A)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)该基因在陆地棉TM -1D亚组(GhGLU19D)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)与(1)或(2)所述基因的核苷酸序列同源性高于98％且功能相同或相似的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制棉花GhGLU19基因的表达量是利用植物表达载体pBI121，将GhGLU19基因序列以反义方向整合在载体上，构建该基因反义表达载体，通过农杆菌介导法将构建的反义表达载体转化棉花，获得GhGLU19基因表达显著降低的转基因棉花材料。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述提高棉花产量为增加棉花产量性状，具体表现为：(1)增加铃重；(2)增加每铃种子数；(3)增加单株有效铃数；(4)提高衣分；
(5)增强种子活力。
6.一种提高棉花产量的方法，其特征在于，通过抑制棉花GhGLU19基因的表达量提高棉花产量。
7.表达量被抑制后能够提高棉花产量的GhGLU19基因，该基因为(1)～(3)中的任意一种：
(1)该基因在陆地棉TM -1A亚组(GhGLU19A)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)该基因在陆地棉TM -1D亚组(GhGLU19D)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)与(1)或(2)所述基因的核苷酸序列同源性高于98％且功能相同或相似的核苷酸序列。
8.由权利要求7所述的GhGLU19基因编码的蛋白，其特征在于，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
9.含有权利要求7所述GhGLU19基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
10.权利要求9所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高棉花产量及培育棉花新种质中的应用。
权 利 要 求 书1/1页CN 110904131 A
一种棉花GhGlu19基因及其在提高棉花产量中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种棉花GhGLU19基因及其在提高棉花产量中的应用。利用PCR技术，克隆GhGLU19基因全长ORF将其以反义方向整合在pBI121双元载体上，构建该基因反义表达载体；通过农杆菌介导法将载体导入棉花受体W0品系中。通过对转基因后代植株的PCR鉴定和qRT-PCR表达检测分析，获得稳定的转基因纯合株系。经过连续两年的田间性状调查，确定抑制表达GhGLU19基因可以增加棉花产量，更具体地，可以增加铃重、每铃种子数和单株有效铃数，提高衣分，增强种子活力等。
背景技术
[0002]β-1,3-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)水解β-1,3-葡聚糖(胼胝质)，其广泛存在于病毒、细菌、真菌)及种子植物中。在植物中，β-1,3-葡聚糖酶是一个保守的大基因家族，拟南芥中有51个成员，可可中有44个成员，葡萄中有43个基因，二倍体雷蒙德氏棉中有67个成员。β-1,3-葡聚糖酶基因都具有N端的信号肽序列及糖基水解17核心结构域，C端结构一般包括碳水化合物结合模块43(Carbohydrate-Binding Modules family 43,CBM43)结构域及C端疏水序列。根据蛋白结构分类，拟南芥51个β-1,3-葡聚糖酶基因可以分为5种类型(Type 1-Type 5)(Doxey et al.,2007)。具有Type 3的蛋白结构被认为是祖先β-1,3-葡聚糖酶，其功能和细胞分裂有关。在长期的进化过程中，家族中的某些成员丢失了C端的结构域，成熟的蛋白分泌到细胞壁中，进化出诸如抗真菌等新的功能(Doxey et al.,2007)。β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病菌防御反应(Leubner-Metzger and Meins 1999)、细胞分裂、花粉萌发及花粉管伸长(Worrall et al.,1992；Wan et al.,2011)、胞间连丝信号传递(Levy et al.,2007a；Levy et al.,2007b)、冷应激反应(Hincha et al.,1997)、种子萌发及成熟(Leubner-Metzger and Meins 2000)等过程中发挥着重要的作用。
[0003]胼胝质在花粉发育过程中发挥着重要的作用。在雄性配子的发育过程中，胼胝质的合成与降解受到严格的调控。在减数分裂刚开始时，胼胝质在花粉母细胞的初生壁与质膜间沉积，以阻止花粉母细胞之间的结合与融合，以及阻止花粉母细胞与周围二倍体细胞间的融合(Waterkeyn 1962)。在减数分裂结束、四分体结构形成时，胼胝质壁破裂，释放出小孢子(Wan et al.,2011)。
[0004]花粉母细胞胼胝质壁破裂的时间受到严格的调控，胼胝质层提前降解或者阻止胼胝质层的降解，都会影响到四分体的释放，从而导致雄性不育。通过绒毡层特异的启动子将β-1,3-葡聚糖酶基因提前在烟草花粉母细胞中表达，胼胝质层提前降解，释放出不成熟的小孢子，从而导致烟草的雄性不育(Worrall et al.,1992)。通过RNA干扰技术沉默在水稻花器官中表达的β-1,3-葡聚糖酶基因，四分体结构形成时胼胝质层没有被降解，小孢子黏附在一起，没有被释放。后期释放出没有育性的小孢子(Wan et al.,2011)。在绒毡层中提前表达或者沉默β-1,3-葡聚糖酶基因，提前或者阻碍胼胝质层的降解，释放出没有育性的小孢子，从而实现雄性不育，此为雄性不育的分子育种提供了新的思路。
[0005]棉花是重要的经济作物，产量是种植效益的保证。因此，提高产量一直是棉花育种
的重要目标。中国高产育种的主要方法和途径有：国外引种以替代原有低产劣质品种、利用优势培育高产的杂交品种和分子标记辅助育种。尽管产量相关分子标记的开发利用和全基因组序列的释放给棉花分子设计育种提供了很好的基础，但是目前挖掘到的产量性状改良的基因甚少，对产量相关构成因素的分子机制解析很少(喻树迅等，2016)。棉花的产量相关构成因素有：单位面积总株数、单株铃数、铃重和衣分。通过近二十年来新疆北疆棉区的几个主栽品种的种植试验，分析其产量及构成因子变化情况，得出的结论为：单铃重在品种更替中质量呈增加趋势(冯杨等，2016)。因此，寻和克隆调控产量性状相关的基因，尤其是调控铃重变化的基因，利用其创制提高产量的种质资源材料为培育高产棉花品种具有重要的意义。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种通过抑制棉花GhGLU19基因表达提高棉花产量的方法。利用PCR技术，克隆GhGLU19基因全长ORF将其以反义方向整合在pBI121双元载体上，构建该基因反义表达载体；通过农杆菌介导法将载体导入棉花受体W0品系中。通过对转基因后代植株的PCR鉴定和qRT-PCR表达检测分析，获得稳定的转基因纯合株系。经过连续两年的田间性状调查，确定抑制表达GhGLU19基因可以增加棉花产量，更具体地，可以增加铃重、每铃种子数和单株有效铃数，提高衣分，增强种子活力等。
[0007]本发明的又一目的在于提供一种棉花GhGLU19基因，并提供该基因在陆地棉TM-1A 亚组(GhGLU19A)和D亚组(GhGLU19D)中的全长cDNA ORF核苷酸序列。该基因在陆地棉中A亚组和D亚组中编码的氨基酸序列。
[0008]本发明的另一个目的在于提供一种棉花产量显著增加的新种质材料，及其在棉花新品种培育及生产上的应用。
[0009]本发明的目的通过以下技术方案实现：
[0010]棉花GhGLU19基因在提高棉花产量及培育棉花新种质中的应用。该应用为通过抑制棉花GhGLU19基因的表达量提高棉花产量。
[0011]一种提高棉花产量的方法，通过抑制棉花GhGLU19基因的表达量提高棉花产量。[0012]上述的抑制棉花GhGLU19基因的表达量是利用植物表达载体pBI121，将GhGLU19基因以反义方向整合在载体上，构建该基因反义表达载体，通过农杆菌介导法将构建的反义表达载体转入棉花，抑制GhGLU19基因的表达水平。优选的，将GhGLU19基因编码序列以反义方向导入PBI121载体骨架，构建该基因反义表达载体，利用农杆菌介导法将构建的反义表达载体转化棉花，获得降低GhGLU19基因表达的转基因棉花材料。更进一步优选的，所述的降低GhGLU19基因的表达量，是将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示核苷酸序列以反义方向导入PBI121载体骨架，构建该基因反义表达载体。将该载体转化农杆菌菌株LBA4404，利用农杆菌介导法转化棉花，经过棉花愈伤筛选诱导、体细胞胚分化和再生过程，获得降低GhGLU19基因表达的转基因棉花材料，通过对所获得的抑制GhGLU19表达的转基因纯系进行连续两年的大田生长发育指标测定，证明抑制GhGLU19表达在增加铃重、每铃种子数和单株有效铃数，提高衣分，增强种子活力等的作用，对创制高产棉花新品种具有重要的应用价值。
[0013]植物表达载体转入棉花是指转化棉花无菌苗下胚轴茎段，诱导愈伤组织、获取体
细胞胚并获得再生苗。植物表达载体携带的组成型启动子是CaMV35S启动子。
[0014]上述提高棉花产量为增加棉花产量性状，具体表现为：(1)增加铃重；(2)增加每铃种子数；(3)增加单株有效铃数；(4)提高衣分；(5)增强种子活力。
[0015]抑制GhGLU19基因表达能提高棉花产量，所述的GhGLU19基因为(1)～(3)中的任意一种：
[0016](1)该基因在陆地棉TM-1A亚组(GhGLU19A)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0017](2)该基因在陆地棉TM-1D亚组(GhGLU19D)中，其全长cDNA ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0018](3)与(1)或(2)所述基因的核苷酸序列同源性高于98％且功能相同或相似的核苷酸序列。
[0019]由上述的GhGLU19基因编码的蛋白，由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列，由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列编码的蛋白具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列。
[0020]含有上述GhGLU19基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0021]上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高棉花产量及培育棉花新种质中的应用。
[0022]本发明利用植物基因工程技术降低棉花GhGLU19基因的表达量，获取棉花产量增加的新种质材料并将其在生产上进行应用。
[0023]本发明的优点表现在：
[0024]本发明中利用植物基因工程技术创制抑制GhGLU19基因表达的转基因材料，对其进行农艺性状调查发现：铃重等重要的产量指标具有显著提升，为研究产量关键性状形成分子机制和育种应用提供了优异材料。
附图说明
[0025]图1过量表达载体和反义载体；
[0026]其中，A为过量表达载体pBI121-35S：：GhGLU19，B为反义载体pBI121-35S：：antisenseGhGLU19。
[0027]图2 PCR结果证明载体转化成功；
[0028]其中，A为过量表达载体pBI121-35S：：GhGLU19的检测结果，A中从左到右分别为M：marker分子量标记，+：质粒对照，-：受体W0对照，1-12为过量表达载体转基因植株；B为反义载体pBI121-35S：：antisenseGhGLU19的检测结果，从左到右分别为M：marker分子量标记，+：质粒对照，-：受体W0对照，1-9为反义载体转基因植株。
[0029]图3为转基因株系不同组织中GhGLU19基因表达量的实时定量荧光检测结果；[0030]其中，A为反义载体株系(AS19、AS87和AS105)、转基因受体对照(W0)和过量表达株系(OE4、OE39、OE54和OE110)的根中GhGLU19基因的相对表达量；B为茎中GhGLU19基因的相对表达量；C为叶中GhGLU19基因的相对表达量。
[0031]结果显示，在过量表达材料的不同组织中GhGLU19基因的相对表达量均有显著增加，在反义材料的不同组织中GhGLU19基因的相对表达量有明显的降低。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议