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结合CTLA4的抗体及其用途的制作方法

el et al.，(2000)164：5319-5327)。因此，cd28-cd80/86结合相比于ctla4-cd80/86结合的相对量决定了t细胞将经历激活或失能(krummel mf，and allison jp.(1995)j expmed.182：459-465)。此外，ctla4可以通过cd80/cd86触发反向信号，引导吲哚胺-2,3-双加氧酶，造成氨酸代谢和t细胞增殖抑制(boasso a et al.，(2005)blood 105：1574-1581)。
7.ctla4也表达于非t细胞，正常细胞或赘生性细胞(laurent s et al.，(2010)hum immunol 71：934-941；contardi e et al.，(2005)int j cancer 117：538-550)。在赘生性细胞中的持续性ctla4表达，推进血液瘤和实体瘤的进程(pistillo mp et al.，(2003)blood 101：202-209；kosmaczewska a et al.，(2005)leukemia 19：301-304)，且已发现ctla4通路阻断可有效减缓肿瘤生长(leach dr et al.，(1996)271：1734-1736；hirano f et al.，(2005)cancer res.65：1089-1096)。ctla4抗体，伊匹单抗已经批准用于黑素瘤、结直肠癌、肝细胞癌、恶性胸膜间皮瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌。替西木单抗，另一ctla4抗体，处于例如间皮瘤、黑素瘤和肠癌的临床试验中。ctla4抗体也可以与pd-1抗体和/或其他抗肿瘤剂联用。例如，同为ctla4抗体的agen1884在临床中联合pd-1抗体测试对于子宫颈癌、血管肉瘤、肌肉浸润性膀胱癌和软组织肉瘤(包括滑膜肉瘤、神经鞘肿瘤和分叶状肿瘤)的(美国国家癌症研究所)。
8.研究进一步示出，ctla4在例如人免疫缺陷病毒(hiv)的慢性感染中上调，而ctla4单独疗法或与pd-1抗体联用在临床试验中干扰hiv的持续存在(thomas a rasmussen et al.，(2021)clinical infectious diseases ciaa1530；colston e et al.，(2018)plos one 13(6)：e0198158)。伊匹单抗和纳武单抗也正处于爱泼斯坦-巴尔病毒(hhv-4)感染的二期试验中。此外，临床前研究正在探索伊匹单抗在移植物抗宿主病(gvhd)、外周神经损伤和神经纤维瘤i型(冯雷克林霍曾氏病)中的效果。
9.当前正尝试努力发现更多的更有效或具有更理想特性的ctla4结合部位。
10.本技术中任何文件的引用或标识，并不是承认这些文件是本技术的现有技术。

技术实现要素：

11.本技术提供一种分离的单克隆抗体，例如小鼠源、人源、嵌合的或人源化的单克隆抗体，或其抗原结合部位，其与ctla4(例如，人ctla4和猴ctla4)结合，且与现有技术ctla4抗体例如伊匹单抗相比，具有相当(如果不是更高的话)的ctla4结合亲和力、相当(如果不是更高的话)的对于ctla4-cd80/cd86相互作用的阻断活性、以及相当的促进t细胞反应的活性。
12.本技术的抗体或其抗原结合部分可以用于许多应用，包括ctla4蛋白的检测以及ctla4相关疾病的和预防，例如肿瘤和感染性疾病。
13.因此，在一个方面，本技术涉及一种分离的单克隆抗体(例如小鼠源、嵌合的或人源化的抗体)或其抗原结合部分，其与ctla4结合，具有i)重链可变区，其可以包含vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，其中该vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：1、2和3；(2)seq id nos：7、8和9；(3)seq id nos：1、2和13；(4)seq id nos：16、17和18；(5)seq id nos：22、23和24；(6)seq id nos：28、29和30；(7)seq id nos：22、34和24；(8)seq id nos：36、37和38；(9)seq id nos：42、43和44；或(10)seq id nos：48、49和
50具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和或ii)轻链可变区，其可以包含vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中该vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以分别包含与(1)seq id nos：4、5和6；(2)seq id nos：10、11和12；(3)seq id nos：14、5和15；(4)seq id nos：19、20和21；(5)seq id nos：25、26和27；(6)seq id nos：31、32和33；(7)seq id nos：35、26和27；(8)seq id nos：39、40和41；(9)seq id nos：45、46和47；或(10)seq id nos：51、52和53具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
14.本技术的抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区可以包含vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，轻链可变区可以包含vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中vh cdr1区、vh cdr2区、vh cdr3区、vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区可以包含与(1)seq id nos：1、2、3、4、5和6；(2)seq id nos：7、8、9、10、11和12；(3)seq id nos：1、2、13、14、5和15；(4)seq id nos：16、17、18、19、20和21；(5)seq id nos：22、23、24、25、26和27；(6)seq id nos：28、29、30、31、32和33；(7)seq id nos：22、34、24、35、26和27；(8)seq id nos：36、37、38、39、40和41；(9)seq id nos：42、43、44、45、46和47；或(10)seq id nos：48、49、50、51、52和53具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与ctla4结合。
15.本技术的抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与seq id nos：54、55(x1＝a、x2＝v；x1＝a、x2＝a；x1＝g、x2＝v；x1＝g、x2＝a)、58、59(x1＝p、x2＝a、x3＝d；x1＝l、x2＝a、x3＝n；x1＝l、x2＝a、x3＝d；x1＝l、x2＝s、x3＝n)、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与ctla4结合。seq id no：54的氨基酸序列可由seq id nos：80或81的核苷酸序列编码。seq id no：58的氨基酸序列可由seq id nos：86或87的核苷酸序列编码。seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)的氨基酸序列可分别由seq id nos：82和88的核苷酸序列编码。
16.本技术的抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与seq id nos：56、57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y；x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f；x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)、60、61(x1＝t、x2＝v、x3＝f；x1＝v、x2＝p、x3＝f；x1＝v、x2＝p、x3＝y)、63、65、67、69、71、73、75或77具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，其中该抗体或其抗原结合部分与ctla4结合。seq id no：56的氨基酸序列可由seq id no：83或84的核苷酸序列编码。seq id no：60的氨基酸序列可由seq id no：89或90的核苷酸序列编码。seq id no：57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)的氨基酸序列可分别由seq id nos：85和91的核苷酸序列编码。
17.本技术的抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其可以分别包含与(1)seq id nos：54和56；(2)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(3)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(4)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(5)seq id nos：55(x1＝g、x2＝
a)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(6)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(7)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(8)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(9)seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(10)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(11)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(12)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(13)seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(14)seq id nos：58和60；(15)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(16)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(17)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(18)seq id nos：59(x1＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(19)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(20)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(21)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(22)seq id nos：59(x1＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(23)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(24)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(25)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(26)seq id nos：59(x1＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(27)seq id nos：62和63；(28)seq id nos：64和65；(29)seq id nos：66和67；(30)seq id nos：68和69；(31)seq id nos：70和71；(32)seq id nos：72和73；(33)seq id nos：74和75；或(34)seq id nos：76和77具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
18.本技术分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含经二硫键连接的重链和轻链，重链可以包含重链可变区和重链恒定区，轻链可以包含轻链可变区和轻链恒定区，其中重链可变区的c端与重链恒定区的n端相连，轻链可变区的c端与轻链恒定区的n端相连，其中重链可变区和轻链可变区可以包含上述氨基酸序列，且抗体或其抗原结合部分与ctla4结合。重链恒定区可以是igg1、igg2或igg4重链恒定区，例如具有例如seq id no.：78所示氨基酸序列的人igg4重链恒定区。重链恒定区，例如fc片段，可以基因改造成具有降低或增强的fcr结合亲和力。轻链恒定区可以是κ恒定区，例如具有如seq id no.：79所示氨基酸序列的人κ恒定区。seq id nos：78和79的氨基酸序列可分别由seq id nos：92和93的核苷酸序列编码。
19.在一些实施方式中，本技术的抗体可以包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链组成，其中各重链可以包含上述重链恒定区、重链可变区或cdr序列，各轻链可以包含上述轻链恒定区、轻链可变区或cdr序列，其中该抗体与ctla4结合。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是全长抗体，例如igg1、igg2或igg4同种型。在其他实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分可以是单链可变片段(scfv)抗体或抗体片段，例如fab或f(ab’)2片段。
20.本技术还提供双特异性分子，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分，与具有不同于本抗体或其抗原结合部分结合特异性的第二功能基团(例如，第二抗体)连接。本技术还提供免疫偶联物，例如抗体-药物偶联物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部
分，与剂例如细胞毒性剂连接。在另一方面，本技术的抗体或其抗原结合部分可以制备成嵌合抗原受体(car)的一部分。还提供包含该抗原嵌合受体的免疫细胞，例如t细胞和nk细胞。本技术的抗体或其抗原结合部分也可以由溶瘤病毒编码或与溶瘤病毒一起使用。
21.本技术还涉及编码本技术抗体或其抗原结合部分的核酸分子，以及可包含该核酸的表达载体、和可包含该表达载体的宿主细胞。还提供利用宿主细胞制备ctla4抗体或其抗原结合部分的方法，其可以包括以下步骤：(i)在宿主细胞中表达抗体以及(ii)从宿主细胞或其细胞培养物中分离抗体。
22.还提供组合物，其可以包含本技术的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、溶瘤病毒、car、car-t细胞、核酸分子、表达载体或宿主细胞，以及药学上可接受的载体。在一些实施方式中，药物组合物还可以包含例如抗癌剂的剂。
23.在另一方面，本技术提供一种在受试者中调节免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的本技术抗体或其抗原结合部分、或者可选地能够在受试者中表达这些的核酸分子，从而调节受试者中的免疫应答。优选地，本技术的抗体或其抗原结合部分在受试者中加强、刺激或增加免疫应答。
24.在另一方面，本技术提供一种在所需受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用有效量的本技术抗体或其抗原结合部分、或者可选地能够在受试者中表达这些的核酸分子。在一些实施方式中，该方法包括施用本技术的双特异性分子、免疫偶联物、car-t细胞、或者编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。肿瘤可以是实体瘤或血液瘤。在一些实施方式中，肿瘤是实体瘤，包括但不限于，黑素瘤、结直肠癌、肝细胞癌、胸膜间皮瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌)、肾细胞癌、子宫颈癌、血管肉瘤、恶性胸膜间质瘤、转移性移行尿路上皮癌、输尿管癌、尿道癌、尿路癌、头颈癌、鳞状细胞瘤、移行细胞癌(尿路上皮细胞癌)、食管癌、胃癌、胃食管(ge)交界癌、胃食管交接处腺癌、肛门癌、胆管癌、无性细胞瘤、子宫内膜癌、输卵管癌、生殖细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、唾液腺癌、肉瘤、三阴性乳癌(tnbc)、或肌肉浸润性膀胱癌。在一些实施方式中，至少一种其他的抗癌抗体可以与本技术抗体或其抗原结合部分一起施用，例如vista抗体、pd-1抗体、pd-l1抗体、lag-3抗体、tim-3抗体、stat3抗体、和/或ror1抗体。在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如il-2、il-21、gm-csf和/或il-4)或共刺激抗体(例如cd137和/或gitr抗体)一起施用。在其他实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分与化疗剂一起施用，其可以是细胞毒性剂例如表阿霉素、奥沙利铂和/或5-氟尿嘧啶(5-fu)。本技术的抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、人源、嵌合的或人源化的。
25.在另一方面，本技术提供一种在所需受试者中或缓解感染性疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本技术组合物。感染性疾病可以是由病毒、细菌、真菌或支原体感染所引起的疾病。在某些实施方式中，感染性疾病由慢性hiv感染或hhv-4感染引起。在某些实施方式中，受试者可以进一步施用至少一种抗感染剂，例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂或抗支原体剂。
26.基于以下具体描述和实施例，当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明晰，具体描述和实施例不应解读为限制性的。在本技术中引用的所有文献、genbank记录、专利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。
27.另外，本技术的目标是不在本技术中包含任何先前已知的产品、制造该产品的工艺或使用该产品的方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前已知的产品、过程或方法的弃权声明。需要进一步指出的是，本技术并不打算在本技术的范围内包含任何不符合uspto(35u.s.c.
§
112，第一段)或epo(epc，第83条)书面描述要件和可实施性要求的产品、工艺、或产品制造方法或产品使用方法，从而申请人保留权利，并在此公开对任何先前描述的产品、产品制备工艺、或产品使用方法的弃权声明。在本发明的实施中，符合epc第53条(c)和细则第28条(b)和(c)是有利的。明确保留对本技术同族或任何其他同族或任何第三方在先申请中涉及本技术人任何已授权专利的主题的任何实施方式做出明确的弃权声明的所有权利。本文中的任何内容都不应被解释为承诺。
28.应当注意的是，在本技术中，特别是在权利要求和/或段落中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有美国专利法所赋予的意义；例如它们可以表示“包含在内”等；而术语例如“基本由...组成”或“基本由...构成”具有美国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明基本或新特性的元素排除在外。
附图说明
29.以下以示例方式给出但不意在将本技术限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
30.图1a和1b示出在捕获elisa中小鼠源抗体d1h4、d1a7和d1b6(a)、c1g4、d1h3、d1b8、d1d5、d2a4、c1d1和d1g6(b)与人ctla4的结合力。
31.图2a和2b示出在竞争elisa中小鼠源抗体d2a4、c1d1、c1g4、d1b6和d1d5(a)、d1h3、d1a7、d1g6、d1h4和d1b8(b)阻断对照基准物与人ctla4结合的能力。
32.图3a和3b示出在基于细胞的阻断facs检测中小鼠源抗体d1h4、d1a7和d1b6(a)、c1g4、d1h3、d1b8、d1d5、d2a4、c1d1和d1g6(b)阻断ctla4与细胞表面cd80/cd86结合的能力。
33.图4示出在基于细胞的功能检测中小鼠源抗体d2a4、c1d1、c1g4、d1b6、d1d5、d1h3、d1h4、d1g6、d1b8和d1a7阻断ctla4-cd80结合并诱导il-2释放。
34.图5a至5e示出在捕获elisa中嵌合抗体c1g4(a)、d1b6(b)、c1d1(c)、d1d5(d)和d1b8(e)与人ctla4的结合力。
35.图6a和6b示出在基于细胞的阻断facs检测中嵌合抗体c1g4、d1b6和c1d1(a)、d1d5和d1b8(b)阻断ctla4与细胞表面cd80/cd86结合的能力。
36.图7a和7b示出在捕获elisa中人源化抗体huc1d1-v8(a)和hud1d5-v9(b)与人ctla4的结合力。
37.图8a和8b示出在竞争elisa中人源化抗体huc1d1-v8(a)和hud1d5-v9(b)阻断对照基准物-人ctla4结合的能力。
38.图9a和9b示出在基于细胞的阻断facs检测中人源化抗体huc1d1-v8(a)和hud1d5-v9(b)阻断ctla4与细胞表面cd80/cd86结合的能力。
39.图10示出在基于细胞的功能检测中人源化抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9阻断ctla4-cd80结合并诱导il-2释放。
40.图11a和11b示出人源化抗体huc1d1-v8(a)和hud1d5-v9(b)的蛋白热迁移试验的
结果。
具体实施方式
41.为确保更容易地理解本技术，首先定义一些术语。其他的定义贯穿具体描述而给出。
42.术语“ctla4”是指细胞毒t淋巴细胞相关抗原4。术语“ctla4”包含变体、异构体、同源物、直系同源体和旁系同源体。例如，对人ctla4蛋白特异的抗体，在某些情况下，可以与除人以外物种例如猴的ctla4蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人ctla4蛋白特异的抗体可以完全地对人ctla4蛋白特异，并呈现为与其他物种或其他类型没有交叉反应性，或者可以对某些其他物种但非所有其他物种的ctla4发生交叉反应。
43.术语“人ctla4”是指具有来自人的氨基酸序列的ctla4蛋白，例如genbank登录号为np_005205的人ctla4氨基酸序列。术语“猴或猕猴ctla4”以及“小鼠ctla4”分别指猴和小鼠的ctla4序列，例如具有genbank登录号分别为np_001038204.1和np_033973.2的氨基酸序列的那些。
44.术语“免疫应答”是指由例如淋巴细胞、抗原提呈细胞、吞噬细胞、粒细胞和由上述细胞或肝脏生成的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)，引发对于入侵病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或在自身免疫或病理性炎症情况下对于正常人体细胞或组织的选择性损坏、破坏或从人体中消除的过程。
45.本文所用的术语“抗体”是指通过至少一个抗原结合位点识别和特异性结合靶标(例如ctla4)的免疫球蛋白分子，其中抗原结合位点通常位于免疫球蛋白分子的可变区内。如本文所用的，术语包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、单链fv(scfv)抗体、重链抗体(hcab)、轻链抗体(lcab)、多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白、以及任何其他含抗原结合位点的修饰免疫球蛋白分子(例如：双可变结构域免疫球蛋白分子)，只要抗体展现出所需的生物活性。抗体还包括，但不仅限于，小鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人源抗体。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的其重链恒定结构域的特征，抗体可以是五类主要免疫球蛋白类iga、igd、ige、igg和igm或其亚类(同种型)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)中的任意种。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构象。抗体可以是裸露的或与其他分子偶联，包括但不限于毒素和放射性同位素。除非另有明确说明，本文所用的术语“抗体”包括完整抗体的“抗原结合部分”。igg是可以包含经二硫键而内部连接的两条重链(h)和两条轻链(l)的糖蛋白。各重链可以由重链可变区(缩写成vh)和重链恒定区组成。重链恒定区可以由c
h1
、c
h2
和c
h3
这三个结构域组成。各轻链可以由轻链可变区(本文中缩写成v
l
)和轻链恒定区组成。轻链恒定区可以由c
l
这一个结构域组成。vh和v
l
区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间穿插着更加保守的称为骨架区(fr)的区域。各vh和v
l
由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)，的结合。
46.本文中所用的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为“部分抗体”)，是指抗体上保留有特异性结合抗原(例如ctla4蛋白)能力的一个或多个片段。已显示出，抗体的抗原结
合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由v
l
、vh、c
l
和cm结构域构成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含由铰链区二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和c
h1
结构域构成的fd片段；(iv)由抗体单臂的v
l
和vh结构域构成的fv片段；(v)由vh结构域构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(viii)纳米抗体，包含单个可变结构域的重链可变区和两个恒定结构域。此外，尽管fv片段的两个结构域，v
l
和vh，由不同的基因编码，它们可以通过重组的方法经合成接头而连接，其中合成的接头使得它们可以制备为单个蛋白链，其中v
l
和vh区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；和huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这样的单链抗体也意在包括在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段经与完整抗体相同的方式进行应用筛选。
47.本文所用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分离出的与ctla4蛋白特异性结合的抗体，基本不含特异结合ctla4之外蛋白的抗体)。然而，分离出的与人ctla4蛋白特异性结合的抗体可以与其他抗原，例如其他物种的ctla4蛋白，有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
48.本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组成”是指单分子组成的抗体分子的制品。单克隆抗体组成表现出对于特定表位的单结合特异性和亲和力。
49.本文所用的术语“小鼠源抗体”意在包括骨架和cdr区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，恒定区也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本技术的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而引入的突变)。然而，本文所用的术语“小鼠源抗体”不意在包括在小鼠骨架序列中植入得自另一哺乳动物物种种系的cdr序列的抗体。
50.术语“嵌合抗体”是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而制备的抗体。或者更笼统地说，嵌合抗体是含有某一物种的遗传物质以及另一物种遗传物质的抗体。
51.本文所用的术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经经修改而增加与人中天然生成的抗体变体的相似度的抗体。
52.术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(如igm或igg1)。
53.词组“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
54.如本文所用的，“特异结合人ctla4”的抗体是指与人ctla4蛋白(以及可能的来自一种或多种非人物种的ctla4蛋白)结合但基本不与非ctla4蛋白结合的抗体。优选地，抗体以“高亲和力”，即以kd值为5.0x10-8
m以下、更优选1.0x10-8
m以下、更优选7.0x10-9
m以下，结合人ctla4蛋白。
55.如本文所用的，术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即，以kd为1x10-6
m以上、更优选1x10-5
m以上、更优选1x10-4
m以上、更优选1x10-3
m以上、更优选1x10-2
m以上，结合蛋白或细胞。
56.术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指抗体对于靶抗原的kd为1.0x10-6
m以下、更
优选5.0x10-8
m以下、甚至更优选1.0x10-8
m以下，甚至更优选7.0x10-9
m以下，甚至更优选1.0x10-9
m以下。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和性”结合可以会变化。例如，对于igm同种型的“高亲和性”结合是指抗体的kd为10-6
m以下、更优选10-7
m以下、甚至更优选10-8
m以下。
57.本文所用术语“k
assoc”或“k
a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“k
dis”或“k
d”是指特定抗体一抗原相互作用的解离速率。如本文所用，术语“k
d”是指从kd与ka的比(即kd/ka)获得的解离常数，表达为摩尔浓度(m)。可以使用本领域公知的方法确定抗体的kd值。用于确定抗体kd的优选方法是使用表面等离子体共振，优选使用生物传感器系统如biacore
tm
系统。
58.术语“ec
50”，也称为半最大效应浓度，是指在特定暴露时间后引起在基线和最高值之间的中间值反应的抗体浓度。
59.术语“ic
50”，也称为半最大抑制浓度，是指相对于不存在抗体而言，抑制50％特定生物学或生化功能的抗体浓度。
60.术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
61.术语“有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/或减轻疾病或病症的严重程度的本技术抗体的用量。有效量在所疾病的背景下进行理解，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际有效量。
62.本技术的多个方面在以下小节中作进一步详细描述。
63.本技术的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的ctla抗体例如伊匹单抗相比相当(如果不是更好的话)的结合亲和力/能力，与人ctla4特异性结合。
64.本技术的抗体或其抗原结合部分，以与之前所述的ctla抗体例如伊匹单抗相比相当或更高的活性，阻断ctla4与cd80/cd86结合。本技术的抗体或其抗原结合部分促进因ctla4-cd80/cd86结合所抑制的t细胞应答。
65.本技术的抗体或其抗原结合部分是小鼠源、嵌合、或人源化的。
66.本技术的抗体或其抗原结合部分在结构上和化学上如下文和实施例中所表征。抗体的重/轻链可变区的氨基酸序列id编号总结在以下表1中，一些抗体具有同一vh或vl。抗体的重链恒定区可以是具有例如seq id no：78所示的氨基酸序列的人igg4重链恒定区，抗体的轻链恒定区可以是具有例如seq id no：79所示氨基酸序列的人κ恒定区。这些抗体也可以包含小鼠igg4重链恒定区和小鼠κ恒定区。
67.表1中的重链可变区cdr和轻链可变区cdr经kabat编号体系确定。然而，如本领域所公知的，cdr区也可以基于重链/轻链可变区序列经其他体系例如chothia、imgt、abm或contact编号体系/方法确定。
68.结合人ctla4的其他ctla4抗体的vh和v
l
序列(或cdr序列)可以与本公开的ctla4抗体的vh和v
l
序列(或cdr序列)“混合和匹配”。优选地，当vh和v
l
链(或这些链中的cdr)混合并匹配时，来自特定vh/v
l
配对的vh序列被结构上相似的vh序列代替。同样地，优选来自特定vh/v
l
配对的v
l
序列经结构类似的v
l
序列替换。
69.[0070][0071]
因此，在一个实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分包括：
[0072]
(a)包含表1中所列氨基酸序列的重链可变区；和
[0073]
(b)包含表1中所列氨基酸序列的轻链可变区、或另一ctla4抗体的v
l
，其中该抗体特异性结合人ctla4。
[0074]
在另一实施方式中，本技术的抗体或其抗原结合部分包括：
[0075]
(a)列于表1中的重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3；以及
[0076]
(b)列于表1中的轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3，或者另一ctla4抗体的cdr，其中该抗体特异结合人ctla4。
[0077]
在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分包括ctla4抗体的重链可变cdr2区，结合有其他结合人ctla4抗体的cdr区，例如，不同ctla4抗体的重链可变区cdr1和/或cdr3、和/或轻链可变区cdr1、cdr2和/或cdr3。
[0078]
另外，如本领域所公知的，cdr3结构域，独立于cdr1和/或cdr2结构域，可以单独决定抗体对同源抗原的结合特异性，且基于相同的cdr3序列，可预见能产生具有相同结合特异性的多个抗体。参见例如klimka et al.，british j.of cancer83(2)：252-260(2000)；beiboer et al.，j.mol.biol.296：833-849(2000)；rader et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.95∶8910-8915(1998)；barbas et al.，j.am.chem.soc.116：2161-2162(1994)；barbas et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.92∶2529-2533(1995)；ditzel et al.，j.immunol.157：739-749(1996)；berezov et al.，biajournal 8：scientific review 8(2001)；igarashi et al.，j.biochem(tokyo)117：452-7(1995)；bourgeois et al.，j.virol 72：807-10(1998)；levi et al.，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90：4374-8(1993)；polymenis and stoller，j.immunol.152：5218-5329(1994)以及xu and davis，immunity 13：37-45(2000)。也可参见美国专利6,951,646；6,914,128；6,090,38；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905和5,760,185。这些参考文献中的每一个都通过引用的方式整体并入本文。
[0079]
因而，在另一个实施方式中，本技术的抗体包含ctla4抗体重链可变区的cdr2，至少地ctla4抗体重链和/或轻链可变区的cdr3，或另一ctla4抗体重链和/或轻链可变区的cdr3，其中该抗体能够与人ctla4特异性结合。优选这些抗体(a)竞争结合ctla4；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本技术ctla4抗体相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体还可以包含ctla4抗体轻链可变区的cdr2、或另一ctla4抗体轻链可变区的cdr2，其中该抗体能够与人ctla4特异性结合。在另一实施方式中，本技术的抗体可以包含ctla4抗体的重链和/或轻链可变区的cdr1，或另一ctla4抗体的重链和/或轻链可变区的cdr1，其中该抗体能够与人ctla4特异性结合。
[0080]
在另一个实施方式中，本技术的抗体包含cdr1、cdr2和cdr3序列的重链和/或轻链可变区序列，其与本技术的ctla4抗体的可变区相比，区别在于具有一个或多个保守修饰。如本领域所理解的，可以进行一些不消除抗原结合的保守序列修饰。参见例如brummell et al.，(1993)biochem 32：1180-8；de wildt et al.，(1997)prot.eng.10：835-41；komissarov et al.，(1997)j.biol.chem.272：26864-26870；hall et al.，(1992)j.immunol.149：1605-12；kelley and o
′
connell(1993)biochem.32：6862-35；adib-conquy et al.，(1998)int.immunol.10：341-6和beers et al.，(2000)clin.can.res.6：2835-43。
[0081]
因而，在一个实施方式中，抗体包含具有cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区和/
或具有cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区，其中：
[0082]
(a)重链可变区cdr1序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
[0083]
(b)重链可变区cdr2序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；和/或
[0084]
(c)重链可变区cdr3序列包含如上表1所列的序列，及其保守修改；和/或
[0085]
(d)轻链可变区cdr1、和/或cdr2、和/或cdr3序列包含如上表1所列的序列，和/或其保守修改；以及
[0086]
(e)该抗体特异结合人ctla4。
[0087]
本技术的抗体或其抗原结合部分具有以下一个或多个上述的功能特点，例如与人ctla4的高结合亲和力、以及对于ctla4-cd80/cd86的阻断活性。
[0088]
在多个实施方式中，抗体可以是例如小鼠源、人源、人源化或嵌合抗体。
[0089]
本文所用的术语“保守的序列修饰”是指不会显著影响或改变含有这类氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和缺失。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和pcr介导的突变，将修饰引入本技术抗体中。保守氨基酸替换是指将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。已定义出领域内具有相似侧链的氨基酸残基组。这些组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本技术抗体的cdr区中的一个或多个氨基酸残基可以用同一侧链组的其他氨基酸残基替换，且改造后的抗体可以使用本文所述的功能检测测试其保留下来的功能(即上述的功能)。
[0090]
本技术的抗体可以用具备本技术ctla4抗体的一个或多个vh/v
l
序列的抗体为起始原料，制备成修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，vh和/或v
l
)内(例如，在一个或多个cdr区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰。此外以及可选地，抗体可以通过修饰恒定区的残基来进行工程改造，以例如改变抗体的效应功能。
[0091]
在某些实施方式中，cdr植入可以用来工程改造抗体的可变区。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(cdr)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，在个体抗体之间，cdr内的氨基酸序列比cdr外的序列更加多样。因为cdr序列负责大部分抗体-抗原相互作用，可以通过构建包含有将来自特定天然抗体的cdr序列植入到具有不同特性的不同抗体的骨架序列中的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体(参见例如riechmann et al.，(1998)nature 332：323-327；jones et al.，(1986)nature 321：522-525；queen et al.，(1989)proc.natl.acad。又可参见u.s.a.86：10029-10033；美国专利5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0092]
因此，本技术的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3序列，轻链可变区包含具有本技术上述序列的cdr1、cdr2和cdr3序列。尽管这些抗体包含本技术单克隆抗体的vh和v
l cdr序列，它们可以含有不同的骨架序列。
[0093]
这些骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开dna数据库或公开参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在“vbase”人种系序列数据库获
得(可得自www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)，也可以在kabat et al.，(1991)，同上；tomlinson et al.，(1992)j.mol.biol.227：776-798；和cox et al.，(1994)eur.j.immunol.24：827-836获得；上述文件各自的内容通过引用的方式明确并入本文。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系dna序列可以在genbank数据库中得到。例如，下列hco7 humab小鼠中的重链种系序列可得自所附的genbank登录号1-69(ng-0010109、nt
‑‑
024637&bc070333)、3-33(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)和3-7(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)。作为另一例子，以下来自hco12 humab小鼠的重链种系序列可得自genbank登录号1-69(ng-0010109、nt
‑‑
024637&bc070333)、5-51(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、4-34(ng
‑‑
0010109&nt
‑‑
024637)、3-30.3(caj556644)&3-23(aj406678)。
[0094]
通过使用本领域公知的称为空格blast的序列相似性搜索方法(altschul et al.，(1997)，同上)，将抗体蛋白序列与汇编蛋白序列数据库进行比较。
[0095]
用于本技术抗体的优选骨架序列，是结构上与本技术抗体所用的骨架序列相似的那些。v
h cdr1、cdr2和cdr3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者cdr序列可以植入到与种系序列相比包含一个或多个突变的骨架区中。例如，发现了，在一些情况下，为保持或增强抗体的抗原结合能力，在骨架区中突变残基是有益的(参见例如美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
[0096]
另一类的可变区修饰是将vh和/或v
l cdr1、cdr2和/或cdr3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或pcr介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他目标功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入(本领域所知的)保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常对cdr区的改变不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。
[0097]
此外，在另一实施方式中，本技术提供分离的ctla4单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区，其包含：(a)v
h cdr1区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)v
h cdr2区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)v
h cdr3区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)v
l cdr1区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)v
l cdr2区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)v
l cdr3区，其包含本技术的序列，或含有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
[0098]
本技术的基因改造抗体包括，例如为提高抗体特性，在vh和/或v
l
的骨架残基中做出基因修饰的抗体。通常而言，做出这些骨架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个骨架残基“回复突变”成相应的种系序列。更加具体而言，经历体细胞突变的抗体可能包含不同于已得到抗体的种系序列的骨架残基。这些残基可以通过比较抗体骨架序列和得到抗体的种系序列而识别出来。
[0099]
另一类的骨架修饰涉及对骨架区的、或者甚至一个或多个cdr区的一个或多个残基进行突变，以去除t细胞表位，从而减少抗体的潜在免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，
在美国专利公开20030153043中有更加详细的描述。
[0100]
此外，或者作为对骨架或cdr区内修饰的另一种选择，本技术的抗体可以基因修饰成包含fc区内的修饰，通常是为改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，可以对本技术的抗体进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学基团)，或者修饰成改变其糖基化，同样是为改变抗体的一个或多个功能特性。
[0101]
在一个实施方式中，c
h1
铰链区经修饰，改变，例如增加或减少，铰链区半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中作进一步描述。改变c
h1
铰链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
[0102]
在另一个实施方式中，抗体的fc铰链区经突变，以降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入fc铰链片段的c
h2-c
h3
结构域连接区，从而相较于与天然fc-铰链结构域的金黄葡萄球菌蛋白a(spa)结合，该抗体具有削弱的spa结合。该方法在美国专利6，165,745中有更详细的描述。
[0103]
在另一实施方式中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以进行一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
[0104]
另外地或者可选地，可以制备糖基化类型改变的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体或者具有增加的平分型glcnac结构的抗体。经证实，这些改变的糖基化形式增加抗体的adcc活性。这样的糖基化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而完成。糖基化系统改变的细胞在领域中已知，且可以用作表达本技术重组抗体的宿主细胞，以制备糖基化改变的抗体。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因fut8(α(1，6)-岩藻糖基转移酶)，从而在ms704、ms705和ms709细胞系中表达的抗体在其糖中缺失岩藻糖。使用两种替换载体靶向破坏cho/dg44细胞的fut8基因，制备ms704、ms705和ms709 fut8-/-细胞系(参见美国专利公开20040110704和yamane-ohnuki et al.，(2004)biotechnol bioeng 87：614-22)。作为另一个例子，ep 1，176,195记载了具有功能破坏的fut8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，从而通过降低或消除α-1，6键相关酶，在该细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。ep 1,176,195也描述了一种细胞系，其具有较低的向结合抗体fc区的n-乙酰氨基葡萄糖中添加岩藻糖的活性，或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公开文本wo 03/035835描述了cho变体细胞系，lec13细胞，其向asn(297)-连接糖添加岩藻糖的能力降低，从而使得宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见shields et al.，(2002)j.biol.chem.277：26733-26740)。具有改变的糖基化图谱的抗体也可以在鸡蛋中制备，如在pct公开文本wo 06/089231中所述的。或者，具有改变的糖基化图谱的抗体可以在植物细胞如浮萍中制备。在植物体系中制备抗体的方法在对应alston&bird llp律师记录号040989/314911的2006年8月11日提交的美国专利申请中有过记载。可以使用岩藻糖苷酶来切除抗体的岩藻糖残基，例如α-l-岩藻糖苷酶从抗体移除岩藻糖残基(tarentino et al.，(1975)biochem.14：5516-23)。
[0105]
包含在本技术中的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。抗体可以聚乙二醇化，例如增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(peg)，例如peg的活性酯或醛类衍生物，在使一个或多个peg基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，聚乙二醇化通过与活性peg分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”意在包括任何形式的用于衍生其他蛋白的peg，例如单(c
1-c
10
)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。蛋白聚乙二醇化的方法在领域内已知，且可以应用于本技术的抗体。参见，例如epo 154316和ep 0401 384。
[0106]
本技术的抗体可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其不同类别。
[0107]
例如，抗体可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起抗体的免疫原性增高，或由于抗原结合的改变引起抗体的pk变化(marshall et al(1972)annu rev biochem 41：673-702；gala and morrison(2004)j immunol 172：5489-94；wallick et al(1988)j exp med 168：1099-109；spiro(2002)glycobiology 12：43r-56r；parekh et al(1985)nature 316：452-7；mimura et al.，(2000)mol immunol 37：697-706)。已知糖基化发生在含有n-x-s/t序列的基序中。在一些情况下，优选不包含可变区糖基化的ctla4抗体。这可以通过选择在可变区不包含糖基化基序的抗体或者通过使糖基化区域内的残基发生突变来实现。
[0108]
在优选实施方式中，抗体不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能发生在n-g或d-g序列处，引起异天冬氨酸残基的生成，其向多肽链引入链接并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
[0109]
各抗体将具有独特的等电点(pi)，其基本落在6-9.5的ph范围内。igg1抗体的pi通常落在7-9.5的ph范围内，而igg4抗体的pi基本落在6-8的ph范围内。推测pi在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构和不稳定性。因此，优选pi值落在正常范围内的ctla4抗体。这可以通过选择pi在正常范围内的抗体或通过突变带电表面残基来实现。
[0110]
在另一方面，本技术提供编码本技术抗体重链和/或轻链可变区或cdr的核酸分子。核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解液中或处于部分纯化或基本纯化的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或者其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈处于基本纯化的状态”。本技术的核酸可以为例如dna或rna，且可以包含或可以不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cdna分子。
[0111]
本技术的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，下文会进一步描述)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cdna可以通过标准pcr扩增或cdna克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，可以从基因库中回收编码这类抗体的核酸。
[0112]
优选的本技术核酸分子包括编码ctla4单克隆抗体的vh和v
l
序列或cdr的那些。一旦获得了编码vh和v
l
的dna片段，这些dna片段可以进一步通过标准的重组dna技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、fab片段基因或scfv基因。在这些操作中，编码v
l
或vh的dna片段与编码另一蛋白(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一dna片段可操作地
连接。在上下文中使用术语“可操作地连接”是指两个dna片段连接在一起，从而使这两个dna片段编码的氨基酸序列都在框内。
[0113]
编码vh区的分离dna可以通过可操作地连接编码vh的dna与编码重链恒定区(c
h1
、c
h2
和c
h3
)的另一dna分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。重链恒定区可以是iggl、igg2、igg3、igg4、iga、ige、igm或igd恒定区，但是最优选为igg1或igg4恒定区。对于fab片段重链基因，编码vh区的dna可以可操作地与仅编码重链c
h1
恒定区的另一dna分子连接。
[0114]
编码v
l
区的分离dna可以通过可操作地连接编码v
l
的dna与编码轻链恒定区c
l
的另一dna分子而转变成全长轻链基因(以及fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的dna片段可以通过标准pcr扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
[0115]
为创建scfv基因，编码vh和v
l
的dna片段可以可操作地与编码柔性接头例如编码氨基酸序列(gly
4-ser)3的另一片段连接，从而vh和v
l
序列可以表达成一个连续的单链蛋白，其中v
l
和vh区域通过该柔性接头连接(参见，例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；mccafferty et al.，(1990)nature 348：552-554)。
[0116]
本技术的单克隆抗体(mabs)可以使用本领域所公知的kohler and milstein (1975)nature 256：495的体细胞杂交(杂交瘤)技术而制备。其他生产单克隆抗体的实施方式包括b淋巴细胞的病毒或致癌性转化以及噬菌体展示技术。嵌合的或人源化的抗体在本领域内所公知。参见例如美国专利4,816,567、5,225,539、5,530,101、5,585,089、5,693,762和6,180,370，其内容通过引用的方式全部特定地并入本文。
[0117]
本技术的抗体还可以使用例如本领域所公知的重组dna技术与基因转染技术的组合，在宿主细胞转染瘤中生成(例如morrison，s.(1985)science 229：1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的dna插入到一个或多个表达载体中，从而使得基因与转录以及翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”意在表示，抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
[0118]
术语“调控序列”意在包括控制抗体基因的转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调控序列在例如goeddel(gene expression technology.methods in enzymology 185，academic press，san diego，calif.(1990))中有过描述。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括在哺乳动物细胞中引导高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒如腺病毒主要晚期启动子(admlp)和多瘤病毒的启动子和/或增强子。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如srα启动子系统，其包含来自sv40早期启动子的序列和人t细胞白血病i型病毒的长末端重复(takebe et al.，(1988)mol.cell.biol.8：466-472)。选择与使用的表达宿主细胞兼容的表达载体和表达控制序列。
[0119]
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，通过将可变区插入到已经编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体
包括有三种或更多种特异性的分子。
[0125]
双特异性分子可以以多种不同形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子保持传统抗体形式，除其具有两条结合臂且各臂具有不同特异性，而非具有两条相同特异性的结合臂外。在另一个极端的是，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scfv)构成的双特异性分子，即所谓的bs(scfv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同f(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学方法进行制备。参见，例如kufer et al，同上；cao and suresh，bioconjugate chemistry，9(6)，635-644(1998)；和van spriel et al.，immunology today，21(8)，391-397(2000)，以及其中引用的文献。
[0126]
本文还提供优先侵染并杀灭癌细胞的溶瘤病毒。本技术的抗体可以与溶瘤病毒一起使用。或者，编码本技术抗体的溶瘤病毒可以引入到人体中。
[0127]
本文还提供包含ctla4 scfv的嵌合抗原受体(car)，该ctla4 scfv包含本文所述的cdr和重/轻链可变区。
[0128]
ctla4 car可以包含(a)含ctla4 scfv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。
[0129]
car可以在胞外抗原结合域的n-端含有指导新生受体进入内质网的信号肽、以及在胞外抗原结合域的n-端的使受体更容易结合的铰链肽。car优选地在胞内信号传导结构域包含主要胞内信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。主要使用的和最有效的主要胞内信号传导域是包含itam的cd3-ζ胞质结构域，其磷酸化会引起t细胞活化。共刺激信号传导结构域可以衍生自共刺激蛋白，例如cd28、cd137和ox40。
[0130]
car还可以添加增强t细胞扩增、持久性和抗肿瘤活性的因子，例如细胞因子、和共刺激配体。
[0131]
还提供基因修饰的免疫效应细胞，其包含本文提供的car。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t细胞、nk细胞、外周血单核细胞(pbmc)、造血干细胞、多能干细胞、或胚胎干细胞。在一些实施方式中，免疫效应细胞是t细胞。
[0132]
在另一方面，本技术提供一种药物组合物，其可以包含与药学上可接受的载体配制在一起的本技术的一种或多种抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、核酸分子、表达载体、或宿主细胞。当组合物中含有多于一种的抗体(或其抗原结合部分、双特异性分子、car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、核酸分子、表达载体、或宿主细胞)时，抗体或其抗原结合部分、双特异性分子、car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物、核酸分子、表达载体、或宿主细胞可以分开给药。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的活性成分，例如另一抗体或药物，例如抗肿瘤药物。
[0133]
药物组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染剂、矫味剂、包衣、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。在gennaro，ed.，remington：the science and practice of pharmacy，20th ed.(lippincott williams&wilkins2003)中，对合适赋形剂的选择和使用有所教导，其公开内容通过引用的方式并入本文。
[0134]
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮给药(例如通过注射或输注)。基于给药途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其免受酸和其他
可能使其失活的自然条件的影响。本文所用的术语“肠道外给药”是指非肠内和非局部外用的给药给药方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊膜下、蛛网膜下腔、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本技术的抗体可以通过非肠道外的途径给药，例如外用、表皮或粘膜给药，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
[0135]
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高药物浓度的有序结构中。
[0136]
可以与载体材料一起制备成单剂量型的有效成分的量将随着主体和特定给药方式而变，且通常是组合物产生疗效的量。基本而言，以百分比计，该量是与药学上可接受载体组合在一起的约0.01％-约99％。
[0137]
调整给药方案以提供最佳的所需的应答(例如，应答)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，为方便施用和剂量均匀，配置剂量单位型的肠道外组合物。本文所用的剂量单位型是指物理上不连续的单位，适于主体的单次给药；各单位包含计算出来与所需药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的给药频率降低。
[0138]
对于组合物的给药，剂量范围可以为约0.0001-100mg/kg。
[0139]“有效剂量”的本技术ctla4抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子、car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物，优选地引起疾病症状严重程度的降低、疾病无症状期频率和持久度的增加、或预防疾病折磨造成的损伤或残疾。例如，对于荷瘤受试者的，与未接受的受试者相比，优选“有效剂量”对肿瘤生长的抑制至少为约20％、更优选为至少约40％，甚至更优选为至少约60％，更优选至少为约80％。有效量的抗体可以在受试者中减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者通常为人，或者可以是另一哺乳动物。
[0140]
药物组合物可以是控释剂型，包括植入体、经皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。参见，例如，sustained and controlled release drug delivery systems.j.r.robinson，ed.，marcel dekker，inc.，new york，1978。
[0141]
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475，196)，其公开内容通过引用的方式并入本文。
[0142]
在某些实施方式中，可以配制本技术的单克隆抗体，以确保在体内的合适分布。例如，为确保本技术的抗体可以穿越血脑屏障，它们可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331；v.v.ranade(1989)j.clin.pharmacol.29：685；umezawa et al.，(1988)biochem.biophys.resmun.153：1038；bloeman et al.，(1995)febs lett.357：140；m.owais et al.，(1995)antimicrob.agents chemother.39：
180；briscoe et al.，(1995)am.j.physiol.1233：134；schreier et al.，(1994)j.biol.chem.269：9090；keinanen and laukkanen(1994)febs lett.346：123；和killion and fidler(1994)immunomethods 4：273。
[0143]
本技术的组合物有许多体外和体内用途，涉及例如癌症和感染性疾病的。该组合物可以施用于人受试者，例如在体内抑制肿瘤生长、或减少或消除病原体。
[0144]
鉴于本技术的ctla4抗体或其抗原结合部分的逆转ctla4-cd80/cd86介导的t细胞抑制以及促进t细胞应答的能力，本技术提供用于抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向受试者施用本技术的组合物，从而使得受试者体内的肿瘤生长受到抑制。可以通过本技术组合物的肿瘤的非限制性实例，包括，但不仅限于，黑素瘤、结直肠癌、肝细胞癌、胸膜间皮瘤、肺癌(例如非小细胞肺癌)、肾细胞癌、宫颈癌、血管肉瘤、和肌层浸润性膀胱癌。此外，可以使用本技术的抗体来抑制复发或难治恶性肿瘤的生长。
[0145]
在另一个方面，本技术提供联合方法，其中本技术的ctla4抗体或其抗原结合部分、或双特异性分子、car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物与一个或多个对抑制受试者中肿瘤生长有效的其他抗体共同施用。在一个实施方式中，本技术提供一种用于抑制受试者中肿瘤生长的方法，包括向受试者施用ctla4抗体(或其抗原结合部分、或car-t细胞、溶瘤病毒、免疫偶联物)和一个或多个其他抗体，例如vista抗体、lag-3抗体、pd-l1抗体和/或pd-1抗体。在某些实施例中，受试者是人。
[0146]
ctla4信号通路阻断还可以与标准肿瘤相结合。例如，ctla4信号通路阻断可以与lag-3和/或pd-1阻断以及化疗方案相结合。例如，化疗试剂可以与ctla4抗体一起施用，其可以为细胞毒试剂。例如，将表阿霉素、奥沙利铂和5-fu施用给接受ctla4疗法的患者。
[0147]
可选地，ctla4抗体与一个或多个其他抗体(例如，tim-3抗体和/或lag-3抗体和/或pd-1抗体)的联合使用还可以与免疫原剂例如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽类和碳水化合物)和转染有编码免疫刺激因子的基因的细胞相结合(he et al.，(2004)j.immunol.173：4919-28)。可以使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括黑素瘤抗原肽，例如gp100肽、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶，或转染表达细胞因子gm-csf的肿瘤细胞。
[0148]
其他可以与ctla4疗法相结合的疗法包括，但不仅限于，施用白介素-2(il-2)、放疗、手术或激素抑制。
[0149]
在另一个方面，本技术提供联合方法，其中本技术的ctla4抗体或其抗原结合部分与一个或多个对减少或消除病原体有效的一种或多种其他药物一起施用。在一个实施方式中，本技术提供一种用于或缓解受试者中感染性疾病的方法，包括向受试者施用ctla4抗体或其抗原结合部分与一种或多种针对病原体的其他药物，例如抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、或抗支原体剂抗体。在某些实施例中，受试者是人。
[0150]
本文讨论的剂的联合可以作为在药学上可接受载体中的单一组合物同步给药，或者作为在各药物处于药学上可接受载体中的单独组合物同步给药。在另一个实施方式中，剂的联用可以按序施用。
[0151]
此外，如果多于一剂的联合疗法需按序施用，按序给药的顺序可以在每个给药时间点颠倒或者保持相同的顺序，按序给药可以与同步给药相结合，或者任意组合。
[0152]
本技术将在以下实施例中进一步阐明，实施例不应当解读为进一步限制。所有附图和贯穿本技术引用的所有参考文献、genbank序列、专利和公开专利申请均通过引用的方式明确并入本文。
[0153]
实施例
[0154]
实施例1.通过杂交瘤技术制备小鼠源抗ctla4单克隆抗体
[0155]
免疫
[0156]
根据e harlow，d.lane，antibody：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1998所述的方法免疫小鼠。将c-端带人igg1 fc标签的重组人ctla4蛋白(acro biosystems，cat#ct4-h5255)用作免疫原。人ctla4-his蛋白(acro biosystems，cat#ct4-h5229)用于抗血清效价的测定和分泌抗原特异性抗体的杂交瘤的筛选。免疫剂量包含用于初次免疫和增强免疫的25μg人ctla4-fc蛋白/小鼠/注射。为增加免疫应答，在初次免疫和增强免疫中分别使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(sigma，st.louis，mo.，usa)。简而言之，制备佐剂-抗原混合物，首先使用涡旋混合器在小瓶中轻柔地混合佐剂。将所需量的佐剂转移到高压灭菌的1.5ml微量离心管中。将抗原以0.25-0.5mg/ml的浓度配制在pbs或盐水中。然后将计算量的抗原加到含有佐剂的微量离心管中，轻柔地涡旋2分钟混合所得的溶液，以形成油包水的乳状液。之后将佐剂-抗原乳状液吸到合适的注射器中，进行动物注射。以100-200μl的体积，共注射25μg抗原。对各个动物进行免疫，之后基于抗血清效价进行4-5次加强。在细胞融合前，通过腹腔注射对具有较好效价的动物进行最后一次加强。
[0157]
杂交瘤融合和筛选
[0158]
培养小鼠骨髓瘤细胞系(sp2/0-ag14，atcc#crl-1581)的细胞，在细胞融合前达到对数生长期。以无菌方式制备免疫小鼠脾细胞，并根据kohler g，and milstein c，
″
continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity，
″
nature，256：495-497(1975)中提到的方法与骨髓瘤细胞融合。之后将融合的“杂交细胞”在dmem/20％fcs/hat培养基中于96孔细胞板铺板。融合后的7-10天，在显微镜下观察存活的杂交瘤落。在两周后，使用重组人ctla-4-his蛋白，对各孔的上清液进行间接elisa。选出分泌与人ctla-4-his蛋白结合的抗体的阳性杂交瘤，并转移到24孔板中。通过流式细胞术(facs)进一步测试杂交瘤的阻断人ctla-4-fc蛋白与细胞表面cd80/cd86结合的活性。通过有限稀释，对产生人ctla-4高特异结合性和ctla-4-daudi细胞阻断活性的抗体的杂交瘤克隆进行亚克隆，以确保细胞系的单克隆源性，之后纯化单克隆抗体。简单而言，使用5-10倍柱体积的pbs缓冲液冲洗蛋白a琼脂糖谱柱(bestchrom(shanghai)biosciences，cat#aa0273)。杂交瘤单克隆的细胞上清液流经柱子，然后用pbs缓冲液冲洗柱子，直至蛋白吸光度达到基线。用洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸-hcl，ph 2.7)洗脱柱子，并立即收集到含有中性缓冲液(1m tris-hcl，ph 9.0)的1.5ml管中。将含有免疫球蛋白的部分混合，并于4℃在pbs中透析过夜。随后，如下所示对纯化单克隆抗体的功能活性进行体外表征。
[0159]
实施例2.使用biacore表面等离子体共振确定的小鼠源ctla4单克隆抗体的结合亲和力确
[0160]
用biacore t200系统(ge healthcare，pittsburgh，pa，usa)对实施例1中产生的
纯化小鼠源单克隆ctla4抗体(mab)进行结合亲和力和结合动力学表征。
[0161]
表2.小鼠源ctla4抗体的结合亲和力
[0162][0163]
简而言之，使用biacore提供的标准胺偶联试剂盒(ge healthcare，pittsburgh，pa，usa)，将山羊抗小鼠igg(ge healthcare，cat#br100838，小鼠抗体捕获试剂盒)经伯胺而共价连接到cm5芯片(羧甲基右旋糖包被芯片，ge healthcare，cat#br100530)，使用蛋白g芯片(ge healthcare，cat#29-1793-15)用于对照基准物的亲和力测定。生物传感器表面的未反应基团用乙醇胺阻断。然后使本技术的纯化ctla4抗体和ctla4对照基准物(bristol-myers squibb co，cat#ndc：0003-2327-11，又称作或bm)以10μg/ml的浓度、10μl/min的流速流经芯片。然后，将hbs-ep
+
缓冲液(biacore提供)中梯度稀释的重组人ctla4-his(acro biosystems，cat#ct4-h5229，起始浓度80nm，2倍梯度稀释)或猴ctla4-his蛋白(acro biosystems，cat#ct4-c5227，起始浓度80nm，2倍梯度稀释)在，以30μl/min的流速流经芯片。抗原-抗体结合动力学观测2分钟，解离动力学观测10分钟。用biacore评估软件将结合与解离曲线拟合到1∶1langmuir结合模型中。确定kd、ka、和kd值，并总结在以下表2中。
[0164]
本技术的所有小鼠源抗体与人和猴ctla4特异性结合，且与对照基准物相比，具有相当或更高的结合亲和力。抗体c1d1、c1g4、d1d5、d1h4、d1b8和d1a7显示出最高的与人ctla4的结合亲和力。
[0165]
实施例3.小鼠源ctla4抗体的ctla4结合活性
[0166]
通过捕获elisa，测定本技术的小鼠源ctla4抗体与ctla4的结合活性。
[0167]
简而言之，用2μg/ml f(ab
′
)2片段特异的亲和纯化山羊抗小鼠igg(jackson immuno research，cat#115-005-072)的pbs溶液包被96孔板，每孔100μl，于4℃孵育过夜。板用冲洗缓冲液(pbs+0.05％v/v吐温-20，pbst)冲洗一次，然后用200μl/孔封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的pbst)于37℃封闭2小时。冲洗板4次，与100μl/孔梯度稀释的本技术小鼠源ctla4抗体、对照基准物或阴性对照higg(静脉注射用人免疫球蛋白(ph 4)，华兰生物工
程有限公司)(5倍稀释于含2.5％w/v脱脂奶粉的pbst中，起始浓度为10000ng/ml)于37℃孵育40分钟，然后再次洗涤四次。将100μl/孔生物素标记的人ctla4-fc蛋白(acro biosystems，cat#ct4-h5255，26ng/ml于含2.5％脱脂奶粉的pbst中)加入至含有捕获ctla4抗体的板中，37℃孵育40分钟，洗涤四次，与链霉亲和素偶联的hrp(1∶10000稀释于pbst，jackson immuno research，cat#016-030-084，100μl/孔)于37℃孵育40分钟。终洗后，板与100μl/孔底物tmb(innoreagents，cat#tmb-s-002)孵育。室温15分钟后用50μl/孔1m h2so4终止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于tmb，630nm作为参照波长，用od(450-630)值和抗体浓度做图。使用graphpad prism软件对数据进行分析，得出ec
50
值。结果如图1a和1b所示。
[0168]
从图1a-1b可以看出，本技术所有的小鼠源ctla4抗体，除d1b8外，以高结合力与人ctla4特异性结合。
[0169]
实施例4.小鼠源ctla4抗体的对照基准物阻断活性和ctla4-cd80/86阻断活性
[0170]
4.1对照基准物阻断elisa
[0171]
在竞争性elisa检测中测量本技术ctla4抗体的阻断对照基准物-人ctla4结合的能力。简而言之，用1.0μg/ml对照基准物的pbs溶液包被96孔微孔板，100μl/孔，37℃孵育2小时。板用洗涤缓冲液洗涤一次，用200μl含有5％w/v脱脂奶粉的pbst封闭，37℃孵育2小时，洗涤四次。
[0172]
本技术的ctla4抗体或对照用生物素标记的人ctla4-fc(acro biosystems，cat#ct4-h5255，65ng/ml于含有2.5％w/v脱脂奶粉的pbst中)稀释，起始浓度为133.33nm，3倍梯度稀释，于室温孵育40分钟，然后将抗体/人ctla4-fc混合物加至对照基准物包被的板中，100μl/孔。37℃孵育40分钟之后，用洗涤缓冲液再次洗板4次。向板中加入100μl/孔的链霉亲和素偶联hrp(1∶10000稀释于pbst，jackson immuno research，cat#016-030-084，100μl/孔)，37℃孵育40分钟。最后用洗涤缓冲液洗板。最后，加入tmb，用1m h2so4终止反应，在酶标仪中对各孔的吸光度进行读数，使用双波长模式，450nm用于tmb，630nm作为参照波长，然后用od(450-630)值和抗体浓度做图。使用graphpad prism软件对数据进行分析，得出ic
50
值。
[0173]
4.2基于细胞的配体阻断facs
[0174]
采用表达细胞表面人cd80和人cd86的daudi细胞系(ccl-213)，经流式细胞术(facs)评估本技术ctla4抗体的阻断人ctla4-fc蛋白与细胞表面cd80/cd86结合的活性。
[0175]
用人ctla4-fc溶液(acro biosystems，cat#ct4-h5255，1μg/ml于facs缓冲液中)稀释本技术的ctla4抗体、对照基准物、或阴性对照higg(静脉注射用人免疫球蛋白(ph 4)，华兰生物工程有限公司)，起始浓度为33.33nm，2倍梯度稀释，于室温孵育30分钟。从细胞培养瓶中收集对数增长期的daudi细胞，洗涤两次，在含有2％v/v胎牛血清的pbs(facs缓冲液)中重悬。在96孔板中，将daudi细胞，每孔1xl05个细胞，与100μl/孔抗体/ctla4-fc混合物于4℃孵育40分钟。用facs缓冲液洗板两次，然后加入100μl/孔r-藻红素亲和纯化fcγ片段特异的山羊抗人igg(1∶1000稀释于facs缓冲液，jackson immunoresearch，cat#109-115-098)，4℃避光孵育40分钟。细胞洗2次，并在facs缓冲液中重悬。使用becton dickinson facs canto ii-hts设备进行荧光测定。采用graphpad prism软件进行数据分
析，得出ic
a0
值。
[0176]
结果如图2a-2b和3a-3b所示。
[0177]
从图2a-2b可以看出，本技术的大多数抗体能够阻断人ctla4-对照基准物结合，表明本技术的这些抗体结合在与对照基准物相同或相似的表位。抗体d2a4、d1b8和d1h4不能阻断人ctla4与对照基准物结合，表明d2a4、d1b8和d1h4可能结合在不同的表位。
[0178]
图3a-3b示出，本技术的大多数抗体能够以与对照基准物相当或更高的活性阻断ctla4与细胞表面cd80/cd86结合。
[0179]
实施例5.小鼠源ctla4抗体的基于细胞的功能检测
[0180]
对本技术ctla4抗体检测其促进t细胞应答的活性。
[0181]
简而言之，将于20μl补充有10％fbs(gibco，cat#10099-141)和5μg/ml pha(sigma，cat#l1668-5m)的rpmi1640培养液(gibco，cat#11875-093)中的4xl04gs-j1细胞(表达cd28的永生化人t淋巴细胞，genscript，cat#m00611)，在384孔板(corning，cat#3707)的各孔中铺板。将人ctla4-fc(acro biosystems，cat#ct4-h5255)在补充10％fbs的rpmi1640培养液中稀释成8μg/ml，将20μl ctla4-fc加至板的各孔。然后向板的各孔加入于20μl补充有10％fbs的rpmi1640培养液中的2x104gs-c1/cd80细胞(表达细胞表面cd80的永生化抗原递呈细胞，genscript，cat#m00614)，然后加入20μl于补充有10％fbs的rpmi1640培养液中的梯度稀释ctla4抗体(起始浓度333.33nm，2.5倍梯度稀释)。将板置于5％co2孵化器中，37℃，24h。将板离心，使用人il-2htrf试剂盒(cisbio，cat#62hil02peg)测试384孔低容量微孔板(greiner，cat#784075)中上清液的il2水平。用graphpad prism软件分析数据，得出ec
50
值。
[0182]
测试结果如图4所示。
[0183]
可以看出，本技术所有的抗体能够促进t细胞应答，与对照基准物相比，ec
50
稍高，但最大il2释放水平相似。
[0184]
实施例6.嵌合抗体的制备和表征
[0185]
对小鼠源ctla4 mab的重链和轻链可变结构域进行测序，序列id编码总结在表1中。
[0186]
小鼠源ctla4 mab c1g4、d1b6、c1d1、d1d5和d1b8的重链和轻链可变结构域在可读框内分别克隆至人igg4重链(seq id no.：78)和人κ轻链恒定区(seq id no.：79)，其中可变区的c端与各自恒定区的n端相连。
[0187]
将包含编码与人igg4重链恒定区(seq id no：78)相连的重链可变区的核苷酸的载体，与含有编码与人κ轻链恒定区(seq id no：79)相连的轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1∶1的轻/重链构建体比，瞬时转染到200ml的含有1mg/ml pei的293f悬浮细胞培养物中。
[0188]
在摇瓶中6天后，收集含有嵌合抗体的细胞上清液，然后从上述细胞上清液中纯化出嵌合抗体。按照上述实施例的实验操作规程(带有或不带有修改)以及以下描述的实验操作规程，将纯化嵌合抗体在捕获elisa、octet亲和力测试和基于细胞的配体阻断facs中进行测试。
[0189]
通过octet系统(fortebio，octet red 96)对纯化的ctla4嵌合抗体进行结合亲和力和结合动力学的表征。简而言之，将ahc生物传感器(抗人igg fc捕获生物传感器，fortebio)用10mm甘氨酸(ph 1.5)预浸泡3秒，之后浸入含流动缓冲液(含0.5％w/v bsa的
pbst)的孔中3秒，浸泡和浸入步骤重复三次。之后将传感器浸入含5μg/ml嵌合ctla4抗体的hbs-ep
+
溶液或含5μg/ml对照基准物的hbs-ep
+
溶液的孔中100秒，然后浸入含有流动缓冲液的孔中5分钟。在含有流动缓冲液的另一个孔中180秒，跑出新的基线。之后将传感器浸入含有梯度稀释的人ctla4-his蛋白(acro biosystems，cat#ct4-h5229，起始浓度80nm，2倍梯度稀释)的流动缓冲液的孔中100秒，然后浸入基线孔中10分钟。最后，将传感器在10mm甘氨酸(ph 1.5)中预浸泡3秒，然后浸入含流动缓冲液的孔中3秒，浸泡和浸入步骤重复三次。使用fortebio数据分析8.1将结合与解离曲线拟合到1∶1langmuir结合模型中。确定ka、kd和kd值，并总结在以下表3中。
[0190]
对于捕获elisa，用亲和纯化fc
γ
片段特异的山羊抗人igg(jackson immuno research，cat#109-005-008)替代亲和纯化f(ab
′
)2片段特异的山羊抗小鼠igg，100μl/孔。
[0191]
结果如表3、以及图5a-5e和图6a-6b所示。
[0192]
如表3所示，嵌合的ctla4抗体c1g4、c1d1和d1d5，以高于对照基准物的结合亲和力，与人ctla4特异性结合。
[0193]
如图5a-5e和图6a-6b所示，嵌合ctla4抗体具有与其亲代小鼠源mab相似的结合能力和配体阻断活性。在基于细胞的配体阻断facs中，嵌合的ctla4抗体d1b6、c1d1和d1d5具有比更高的阻断活性。
[0194]
表3.嵌合抗体与人ctla4的结合亲和力
[0195][0196]
*d1b8未测试
[0197]
实施例7.小鼠源ctla4单克隆抗体c1d1和d1d5的人源化
[0198]
选择小鼠源ctla4抗体c1d1和d1d5进行人源化和进一步的研究。小鼠源抗体的人源化使用成熟的cdr移植技术进行，下文会详细描述。
[0199]
为给小鼠源抗体c1d1和d1d5的人源化选择合适的受体框架，将每个小鼠源抗体的轻链和重链可变区序列在人免疫球蛋白基因数据库中进行比对。选出具有最高同源性的人种系，作为人源化的受体框架。将小鼠源抗体重链/轻链可变区cdr插入到选中的框架中，对框架中的残基进行进一步的回复突变，以获得更多的候选重链/轻链可变区。一共得到12个人源化的c1d1抗体，即huc1d1-v1到huc1d1-v12，以及12个人源化的d1d5抗体，即hud1d5-v1到hud1d5-v12，其重链/轻链可变区序列id编号如表1所示。
[0200]
将包含编码与人igg4重链恒定区(seq id no：78)相连的人源化重链可变区的核苷酸的载体，与包含编码与人κ轻链恒定区(seq id no：79)相连的人源化轻链可变区的核苷酸的载体，以1.1∶1轻/重链构建体比，瞬时转染到200ml含有1mg/ml pei的293f悬浮细胞
培养物中。
[0201]
实施例8.人源化抗体的表征
[0202]
表4.人源化c1d1 mab的结合亲和力
[0203][0204]
表5.人源化d1d5 mab的结合亲和力
[0205]
[0206]
在摇瓶中6天后，收集含有人源化抗体的细胞上清液，然后按照上述的实验操作规程，通过octet测定其、以及浓度为5μg/ml且在hbs-ep
+
中的嵌合抗体和对照基准物与人ctla4的结合亲和力。得出ka、kd和kd值，并总结在下表4和表5中。
[0207]
数据表明，所有含有人源化c1d1抗体的细胞上清液显示出比基准对照物更高的人ctla4结合亲和力，含有huctla4 d1d5-v1到huctla4 d1d5-v3的细胞上清液显示出比对照基准物更高的人ctla4结合亲和力。
[0208]
将人源化抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9如上所述进行纯化，并按照前述实施例的操作步骤(加以微小修改)在biacore、捕获elisa、对照基准物阻断elisa、基于细胞的配体阻断facs和基于细胞的t细胞应答促进测试中进行检测。在捕获elisa试验中，用2μg/ml山羊抗人igg(亲和纯化山羊抗人igg，f(ab
′
)2片段特异，jackson immunoresearch，cat#109-005-097)替代山羊抗小鼠igg f(ab
′
)2片段来包被96孔微孔板，100μl/孔。在biacore测试中，山羊抗人igg(ge healthcare，cat#br100839，人抗体捕获试剂盒)替代山羊抗小鼠igg而共价连接到cm5芯片，且将cm5芯片用于对照基准物，而非蛋白g芯片。
[0209]
使用glomelt
tm
热迁移蛋白稳定试剂盒(biotium，cat#33022-t)，在热稳定性检测中测定纯化的抗体，以确定tm(熔融温度)。简而言之，将glomelt
tm
染料融化至室温。将装有染料的小瓶进行涡旋振荡和离心。然后，通过向95μl pbs加入5μl 200x染料，制备10x染料。加入2μl 10x染料和10μg人源化抗体，然后加入pbs至总反应体积20μl。简单地旋转含有染料和抗体的管子，并置于实时pcr热循环仪(roche，lightcycler 480ii)中，将其设置为具有表6参数的熔融曲线程序。
[0210]
表6.熔融曲线程序参数
[0211]
大概步骤温度升温速率保持时间初始保持25℃na30s熔融曲线25-99℃0.1℃/sna
[0212]
结果如表7和图7a-7b、图8a-8b、图9a-9b、图10和图11a-11b所示。
[0213]
表7.人源化抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9的结合亲和力
[0214][0215]
从表7可以看出，抗体huc1d1-v8显示出比亲本抗体或基准对照物更低的人ctla4和猴ctla4结合亲和力。图9a示出该抗体有效地阻断了ctla4与细胞表面cd80/cd86的结合，且阻断活性与对照基准物相当。
[0216]
从表7可以看出，抗体hud1d5-v9具有相当的人ctla4和猴ctla4结合亲和力。图9b示出，该抗体以比基准对照物稍高的阻断力有效地阻断了ctla4与细胞表面cd80/cd86的结
合。
[0217]
根据图8a-8b，本技术的人源化抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9能够阻断人ctla4-bm结合，说明本技术的抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9很可能结合在与bm相似的表位。
[0218]
如图10所示，本技术的人源化抗体huc1d1-v8和hud1d5-v9具有与bm相当的促进t细胞应答的活性。
[0219]
尽管本技术已经结合一个或多个实施方式在以上进行了阐述，应当理解的是，本技术不限于那些实施方式，且说明书意在涵盖包括在所附权利要求的宗旨和范围内的所有可选方案、修改和等同物。所有本文中引用的参考文献均通过引用的方式全文并入。
[0220]
本技术中的序列总结如下。
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230][0231]
***
[0232]
尽管已经在本技术的具体优选实施方式中进行了阐述，应当理解的是，由上述段落定义的本发明不限于在上述描述中列出的特定细节，可以在不脱离本发明宗旨和范围的情况下做出很多明显的变形。

技术特征：

1.一种结合细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4)的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含：i)重链可变区，其包含vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区，其中该vh cdr1区、vh cdr2区和vh cdr3区分别包含与(1)seq id nos：1、2和3；(2)seq id nos：7、8和9；(3)seq id nos：1、2和13；(4)seq id nos：16、17和18；(5)seq id nos：22、23和24；(6)seq id nos：28、29和30；(7)seq id nos：22、34和24；(8)seq id nos：36、37和38；(9)seq id nos：42、43和44；或(10)seq id nos：48、49和50具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，其包含vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区，其中该vl cdr1区、vl cdr2区和vl cdr3区分别包含与(1)seq id nos：4、5和6；(2)seq id nos：10、11和12；(3)seq id nos：14、5和15；(4)seq id nos：19、20和21；(5)seq id nos：25、26和27；(6)seq id nos：31、32和33；(7)seq id nos：35、26和27；(8)seq id nos：39、40和41；(9)seq id nos：45、46和47；或(10)seq id nos：51、52和53具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区包含与seq id nos：54、55(x1＝a、x2＝v；x1＝a、x2＝a；x1＝g、x2＝v；x1＝g、x2＝a)、58、59(x1＝p、x2＝a、x3＝d；x1＝l、x2＝a、x3＝n；x1＝l、x2＝a、x3＝d；x1＝l、x2＝s、x3＝n)、62、64、66、68、70、72、74或76具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该轻链可变区包含与seq id nos：56、57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y；x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f；x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)、60、61(x1＝t、x2＝v、x3＝f；x1＝v、x2＝p、x3＝f；x1＝v、x2＝p、x3＝y)、63、65、67、69、71、73、75或77具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该重链可变区和该轻链可变区包含与(1)seq id nos：54和56；(2)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(3)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(4)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(5)seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝m、x3＝r、x4＝y)；(6)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(7)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(8)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(9)seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和57(x1＝s、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(10)seq id nos：55(x1＝a、x2＝v)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(11)seq id nos：55(x1＝a、x2＝a)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(12)seq id nos：55(x1＝g、x2＝v)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(13)seq id nos：55(x1＝g、x2＝a)和57(x1＝v、x2＝v、x3＝t、x4＝f)；(14)seq id nos：58和60；(15)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(16)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(17)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(18)seq id nos：59(xl＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝t、x2＝v、x3＝f)；(19)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、
x3＝f)；(20)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(21)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(22)seq id nos：59(x1＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝f)；(23)seq id nos：59(x1＝p、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(24)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(25)seq id nos：59(x1＝l、x2＝a、x3＝d)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(26)seq id nos：59(x1＝l、x2＝s、x3＝n)和61(x1＝v、x2＝p、x3＝y)；(27)seq id nos：62和63；(28)seq id nos：64和65；(29)seq id nos：66和67；(30)seq id nos：68和69；(31)seq id nos：70和71；(32)seq id nos：72和73；(33)seq id nos：74和75；或(34)seq id nos：76和77具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。5.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链恒定区和轻链恒定区，该重链恒定区具有seq id no：78所示的氨基酸序列，与重链可变区相连，该轻链恒定区具有seq id no：79所示的氨基酸序列，与轻链可变区相连。6.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其(a)与人ctla4结合；(b)与猴ctla4结合；(c)阻断ctla4-cd80/cd86相互作用；和/或(d)促进t细胞应答。7.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为小鼠源、嵌合的或人源化的抗体。8.如权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为igg1、igg2或igg4亚型。9.一种核苷酸，其编码权利要求1至8中任一所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的核苷酸。11.一种宿主细胞，其包含权利要求9所述的核苷酸或权利要求10所述的表达载体。12.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分、权利要求9所述的核苷酸、权利要求10所述的表达载体、或权利要求11所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。13.如权利要求12所述的药物组合物，还包含抗肿瘤剂。14.如权利要求12所述的药物组合物，还包含抗感染剂。15.一种在有需求的受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向该受试者施用有效量的权利要求12或13所述的药物组合物。16.如权利要求15所述的方法，其中肿瘤为黑素瘤、结直肠癌、肝细胞癌、胸膜间皮瘤、肺癌、肾细胞癌、子宫颈癌、血管肉瘤、恶性胸膜间质瘤、转移性移行尿路上皮癌、输尿管癌、尿道癌、尿路癌、头颈癌、鳞状细胞瘤、移行细胞癌(尿路上皮细胞癌)、食管癌、胃癌、胃食管(ge)交界癌、胃食管交接处腺癌、肛门癌、胆管癌、无性细胞瘤、子宫内膜癌、输卵管癌、生殖细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、腹膜癌、前列腺癌、唾液腺癌、肉瘤、三阴性乳癌(tnbc)、或肌肉浸润性膀胱癌。17.一种在有需求的受试者中或缓解感染性疾病的方法，包括向该受试者施用有效量的权利要求12或14所述的药物组合物。18.如权利要求17所述的方法，其中感染性疾病由慢性hiv感染或hhv-4感染引起。

技术总结

本申请涉及一种与人CTLA4特异性结合的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。还提供编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法。本申请还提供包含抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物、双特异性分子、嵌合抗原受体、溶瘤病毒、和药物组合物，以及使用CTLA4抗体或其抗原结合部分的方法。其抗原结合部分的方法。