(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610652680.4
(22)申请日 2016.08.10
(71)申请人 成都生物制品研究所有限责任公司
地址 610200 四川省成都市锦江区锦华路
三段379号
(72)发明人 秦敏 张华 杨国友 唐朝晖
吴永超 顾洁 耿其秀
(74)专利代理机构 成都高远知识产权代理事务
所(普通合伙) 51222
代理人 李高峡 张娟
(51)Int.Cl.
C07K 14/33(2006.01)
C07K 1/36(2006.01)
C07K 1/34(2006.01)
C07K 1/30(2006.01)
(54)发明名称
(57)摘要
法，它包括如下步骤：(1)取破伤风梭状芽孢杆菌
培养液，杀菌，离心，澄清过滤，得上清；(2)取上
清液，超滤，分次加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度
为22～26(w/v)，离心，收集沉淀，将沉淀溶解后
超滤，即为精素；(3)将精素用注射用水
稀释后，加入甲醛溶液，脱毒，即可。本发明方法
制备的破伤风类毒素质量优良，纯度高、单体含
量高和残余氨基含量高、效力好、毒性低，且制备
工艺稳定，操作方便，批间差异控制良好，硫酸
铵、甲醛用量少，成本低廉，
应用前景良好。权利要求书1页 说明书5页 附图1页CN 106167519 A 2016.11.30
C N 106167519
A
1.一种破伤风类毒素的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取破伤风梭状芽孢杆菌培养液，杀菌，离心，澄清过滤，得上清；
(2)取上清液，超滤，分次加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为22～26(w/v)，离心，收集沉淀，将沉淀溶解后超滤，即为精素；
(3)将精素用注射用水稀释后，加入甲醛溶液，脱毒，即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述破伤风梭状芽孢杆菌培养液的破伤风毒素絮状单位不低于80Lf/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，采用连续流离心去除菌体，离心的转速为13000～15000转/分钟，优选13000转/分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，离心采用连续流离心机离心；和/或，澄清过滤采用复合滤芯进行澄清过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，超滤至原体积的1/15～1/10；超滤的进液压力为0.15～0.4MPa，回流压力为0.05～0.2MPa；和/或，超滤采用膜孔径为30～50kD超滤膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，分次加入硫酸铵至超滤浓缩液的方式是：第一次加入15～19％，第二次加入5～9％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，离心的转速为4000～6000转/分钟，离心的时间为40～60分钟。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，超滤至残余硫酸铵浓度小于千分之一；和/或，超滤采用膜孔径为30～50kD超滤膜。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.15～0.25％(v/v)，脱毒的温度为36～38℃，脱毒的时间为15～30天。
10.权利要求1～9任意一项所述方法制备得到的破伤风类毒素。
权 利 要 求 书1/1页CN 106167519 A
一种破伤风类毒素的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物制品领域，具体涉及一种制备破伤风类毒素的方法。
背景技术
[0002]破伤风是破伤风杆菌经由皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生毒素而引起阵发性肌痉挛的一种特异性感染。典型症状是在肌紧张性收缩(肌强直、发硬)的基础上，阵发性强烈痉挛，通常最先受影响的肌是咀嚼肌，随后顺序为面部表情肌、颈、背、腹、四肢肌，最后为膈肌。
[0003]破伤风毒素是破伤风杆菌产生的一种神经蛋白质毒素，通过抑制性神经递质的释放，引起超反射反应和横纹肌痉挛。1926年，Roman等人首次将甲醛处理的破伤风毒素成功用于人免疫预防破伤风，自此开创了破伤风类毒素免疫的新纪元，随着其单苗或联苗在世界范围内的接种，有效预防控制了破伤风的爆发流行。WHO网站公布的数据显示，2014年破伤风类毒素单价疫苗或联合疫苗在全球的免疫覆盖率达到86％。破伤风类毒素除作为单价疫苗或吸附百白破联合疫苗用于婴幼儿及适宜人的预防接种外，还作为载体蛋白制备多糖结合疫苗如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、脑膜炎球菌结合疫苗和肺炎球菌结合疫苗。[0004]破伤风类毒素是百白破多联疫苗的重要成分，单体含量高不易造成接种副反应，更多的残余氨基说明抗原完整性好，免疫保护性更好。单体含量高、残留氨基高的破伤风类毒素成分更有利于开发出更安全有效的多联疫苗。
[0005]破伤风类毒素生产工艺有两类：一种为原素先脱毒后精制工艺，另一种为原素先精制后脱毒工艺。先脱毒后精制工艺制备的破伤风类毒素稳定性一般较好，但是原素中含有的培养基
残留物，在脱毒过程中可能与甲醛及毒素分子交联，在后续的精制提纯中去除困难，增加出现过敏反应的几率，且脱毒体积大，成本偏高。先精制后脱毒工艺则有效去除了培养基中的致敏物质，且脱毒体积小、便于操作，工艺批间差异易控制。[0006]并且，通常生产的破伤风类毒素单体含量和残余氨基的含量均较低，单体含量平均约为70％，残余氨基平均仅20mol-NH/molTT。
[0007]因此生产工艺进行持续改进可获得更高质量的制品。
发明内容
[0008]本发明提供了一种破伤风类毒素的制备方法以及该方法制备得到的破伤风类毒素。
[0009]本发明破伤风类毒素的制备方法，它包括如下步骤：
[0010](1)取破伤风梭状芽孢杆菌培养液，杀菌，离心，澄清过滤，得上清；
[0011](2)取上清液，超滤，分次加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为22～26(w/v)，离心，收集沉淀，将沉淀溶解后超滤，即为精素；
[0012](3)将精素用注射用水稀释后，加入甲醛溶液，脱毒，即可。
[0013]步骤(1)中，所述破伤风梭状芽孢杆菌培养方式为静止培养，不通气、不搅拌，培养
液的破伤风毒素絮状单位不低于80Lf/ml时收获毒素。
[0014]优选地，本发明破伤风类毒素的制备方法为大工业生产中的制备方法。
[0015]步骤(1)中，采用连续流离心去除菌体，离心的转速为13000～15000转/分钟，优选离心的转速为13000转/分钟。
[0016]步骤(1)中，离心采用连续流离心机离心；和/或，澄清过滤采用复合滤芯进行澄清过滤。
[0017]步骤(2)中，超滤至原体积的1/15～1/10；超滤的进液压力为0.15～0.4MPa，回流压力为0.05～0.2MPa；和/或，超滤采用膜孔径为30～50kD超滤膜。
[0018]步骤(2)中，分次加入硫酸铵至超滤浓缩液的方式是：第一次加入15～19％，第二次加入5～9％。
[0019]步骤(2)中，离心的转速为4000～6000转/分钟，离心的时间为40～60分钟。[0020]步骤(2)中，超滤至残余硫酸铵浓度小于千分之一；和/或，超滤采用膜孔径为30～50kD超滤膜。
[0021]步骤(3)中，加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.15～0.25％(v/v)，脱毒的温度为36～38℃，脱毒的时间为15～30天。
[0022]本发明还提供了前述方法制备得到的破伤风类毒素。
[0023]综上，本发明方法在大工业生产下制备的破伤风类毒素质量优良，纯度高，单体含量高于85％，残余氨基含量高于35mol-NH/molTT，效力好、毒性低，且制备过程可控度相对更高，操作方便，脱毒体积小，甲醛、硫酸铵用量少，利于环保，应用前景良好。
[0024]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。[0025]以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0026]图1 3批破伤风类毒素280nm下HPLC分析峰型结果，三批峰图高度重合进一步证明产品的批间一致性。
具体实施方式
[0027]菌株：破伤风梭状芽孢杆菌L58株(保藏号为：CMCC64008)
[0028]仪器和试剂：DHP-9902电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；破伤风1000L发酵罐购自成都英德生物工程公司；GQLY-125N连续流离心机购自辽宁阳光制药机械有限公司；超滤膜、复合滤芯均购自颇尔过滤器(北京)有限公司；FILTRON超滤器购自日本；RC12BP索华低速大容量离心机购自美国科峻公司；SASO11G23J弹筒滤器购自颇尔过滤器(北京)有限公司；恒温孵室为公司自建。 [0029]甲醛溶液购自广东光华科技股份有限公司；碳酸氢钠购自自贡鸿鹤制药有限责任公司；硫酸铵购自成都市科龙化工试剂厂。
[0030]实施例1本发明制备破伤风类毒素的方法
[0031]一、制备方法
[0032] 1.破伤风类毒素培养
[0033]检定合格的破伤风梭状芽孢杆菌启开后进行传代，后进行厌氧静止培养，至得到破伤风毒素絮状单位达到80Lf/ml的培养液，对培养液进行杀菌(甲醛杀菌)。
[0034] 2.收集培养液上清
[0035]对杀菌后的培养液进行离心，具体是经连续流离心机13000转/分钟离心收集上清，再经复合滤芯进行澄清过滤。
[0036] 3.上清液超滤浓缩
[0037]上清液经30kD超滤膜包超滤至原体积的1/10，进液压力为0.15～0.4MPa，回流压力为0.05～0.2MPa。
[0038] 4.分段盐析
[0039]分次向超滤浓缩液中加入固体硫酸铵，第一次加入17％，第二次加入5％，共计加入22％(g/ml)进行盐析。4000转/分钟离心60分钟收集沉淀、溶解后用30KD滤膜等体积超滤至残余硫酸铵浓度小于千分之一，即为精素。
[0040] 5.脱毒
[0041]精素用注射用水稀释2.1倍后，加入甲醛溶液至终浓度为0.25％(ml/ml)，置36～38℃脱毒15天，脱毒检查合格即为类毒素。
[0042]二、收率
[0043]本发明制备方法在培养体积为800L的情况下，制备破伤风类毒素的收率为62.7％。
[0044]实施例2本发明制备破伤风类毒素的方法
[0045]一、制备方法
[0046] 1.破伤风类毒素培养
[0047]检定合格的破伤风梭状芽孢杆菌启开后进行传代，后进行厌氧静止培养，至得到破伤风毒素絮状单位达到100Lf/ml的培养液，对培养液进行杀菌(甲醛杀菌)。
[0048] 2.收集培养液上清
[0049]对杀菌后的培养液进行离心，具体是经连续流离心机14000转/分钟离心收集上清，再经复合滤芯进行澄清过滤。
[0050] 3.上清液超滤浓缩
[0051]上清液经50kD超滤膜包超滤至原体积的1/13，进液压力为0.15～0.4MPa，回流压力为0.05～0.2MPa。
[0052] 4.分段盐析
[0053]分次向超滤浓缩液中加入固体硫酸铵，第一次加入19％，第二次加入7％，共计加入26％(g/ml)进行盐析。5000转/分钟离心50分钟收集沉淀、溶解后用50KD滤膜等体积超滤至残余硫酸铵浓度小于千分之一，即为精素。
[0054] 5.脱毒
[0055]精素用注射用水稀释1.9倍后，加入甲醛溶液至终浓度0.20％(ml/ml)，置36～38℃脱毒20天，脱毒检查合格即为类毒素。
[0056]二、收率
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