(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810818093.7
(22)申请日 2018.07.24
(71)申请人 郑州师范学院
地址 450044 河南省郑州市惠济区英才街6
号
(72)发明人 蒋素华 马杰 梁芳 许申平
张燕 王默霏 袁秀云 崔波
李艳辉
(74)专利代理机构 郑州联科专利事务所(普通
合伙) 41104
代理人 时立新
(51)Int.Cl.
C12N 15/29(2006.01)
C12N 15/10(2006.01)
C12Q 1/6895(2018.01)
C12Q 1/6851(2018.01) (54)发明名称
(57)摘要
本申请属于白及基因工程技术领域，具体涉
及一个白及内参基因EF1α及其应用专利申请事
宜。该基因包括620bp碱基，如SEQ ID NO.1所示。
该基因可作为内参基因用于分析评价相关功能
体而言，本申请中首次对白及中的EF1α基因进
行了克隆，并对其作为内参基因的功能做了初步
研究，结果表明，其可以较好地作为内参基因加
以应用，能够较为准确的为相关基因的荧光定量
表达分析奠定应用基础，具有较好地实用价值和
科研应用价值。权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页CN 109022448 A 2018.12.18
C N 109022448
A
1.一个白及内参基因EF1α，其特征在于，该基因包括620bp碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ACATCAACATTGTGGTCATTGGTCATGTCGACTCTGGGAAATCGACCACCACTGGTCATCTCATATACAAGCT TGGCGGTATTGATAAACGTGTGATCGAGAGGTTTGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGATCATTCAAGTACG CATGGGTGCTCGACAAGCTCAAAGCTGAGCGTGAGCGCGGTATTACCATTGATATCGCTCTGTGGAAATTCGAGACC ACGAAATACTATTGCACTGTCATTGATGCCCCCGGACATCGCGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGAACCTCTCA GGCAGATTGTGCCGTCCTTATTATTGATTCCACGACTGGAGGCTTTGAAGCTGGTATCTCCAAAGATGGCCAGACTC
GTGAACATGCCCTCCTTGCTTTTACTCTCGGTGTTAAACAGATGATTTGTTGCTGCAACAAGATGGATGCAACTACA CCCAAGTACTCAAAAGCAAGGTATGATGAGATTGTGAAGGAGGTTTCCTCCTACCTCAAGAAGGTTGGTTACAATCC TGATAAGATCCCATTTGTACCAATCTCCGGATTCGAAGGTGACAACATGATTGACAGATCAACCAACCTTGACTGGT ACAAAGGC。
2.权利要求1所述白及内参基因EF1α的制备方法，其特征在于，采用PCR扩增获得，PCR 扩增时，具体引物序列设计如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG -3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG -3。
3.权利要求1所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，其特征在于，作为内参基因应用。
4.如权利要求3所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，其特征在于，EF1α作为内参基因用于功能基因蔗糖合成酶基因的分析。
5.利用权利要求1所述白及内参基因EF1α的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，检测分析时，引物序列设计如下：
QBJEF1aF: 5'-GCCGTCCTTATTATTGATTCCA -3'，
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA -3'。
权 利 要 求 书1/1页CN 109022448 A
一个白及内参基因EF1α及其应用
技术领域
[0001]本申请属于白及基因工程技术领域，具体涉及一个白及内参基因EF1α及其应用专利申请事宜。
背景技术
[0002]白及（Bletilla striata），又白芨，属兰科白及属（白及属共有6种，均产于东亚），多年生草本，高20～50厘米，叶4～5枚，基部互相套叠成茎状，中央抽出花葶，总状花序具数朵花，地下有粗厚的块茎，如鸡头状，富粘性，含白及胶质，即白及甘露聚糖，可供药用，有止血补肺、生肌止痛之效，同时也常作糊料应用。
[0003]植物基因组研究中，就EF1α基因表达研究而言，一般认为其基因表达及调控非常保守，几乎存在于每个细胞内，仅次于肌动蛋白，在真核生物体内属于数量较多的一类蛋白。就其功能研究而言，一般认为EF1α是主要的翻译因子之一，主要用于调控蛋白质的翻译过程，是一种在蛋白质合成中起重
要作用的延伸因子。另有研究认为，其还与细胞生长与增殖速度有关，除参与翻译控制、应激反应、细胞生长和运动性有关的信号传导外，还可与细胞结构结合，如细胞骨架和有丝分裂装置等，与细胞骨架的结合可以显著提高蛋白质的翻译。但总体而言，随物种不同、表达部位不同，其功能也有所不同。例如，有研究发现，eEF1A 在香蕉果实采摘后的不同时期以及在香蕉不同器官中的表达都有差异，即其在细胞中的表达并不是恒定不变，在不同的生理状态下，不同的细胞类型中都有差异。
[0004]总之，就EF1α基因研究而言，在多种植物中均可以克隆获得，如：蝴蝶兰、油桐、油棕、玉米、拟南芥、苹果、沙梨、碧桃、可可树、中果咖啡、亚麻芥、金丝小枣、甘蔗、棉花、玫瑰和水稻等等，但在白及中，尚未见到有关该基因的相关报道。
发明内容
[0005]鉴于EF1α基因功能的多样性和重要性，本申请对白及中EF1α基因及其功能进行了研究，从而为白及相关基因工程工作开展奠定基础。
[0006]本申请所采取的技术方案详述如下。
[0007]一个白及内参基因EF1α，包括620bp碱基，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
ACATCAACATTGTGGTCATTGGTCATGTCGACTCTGGGAAATCGACCACCACTGGTCATCTCATATACAAGCT
TGGCGGTATTGATAAACGTGTGATCGAGAGGTTTGAGAAGGAAGCTGCTGAGATGAACAAAAGATCATTCAAGTACG CATGGGTGCTCGACAAGCTCAAAGCTGAGCGTGAGCGCGGTATTACCATTGATATCGCTCTGTGGAAATTCGAGACC ACGAAATACTATTGCACTGTCATTGATGCCCCCGGACATCGCGATTTTATCAAGAACATGATCACCGGAACCTCTCA GGCAGATTGTGCCGTCCTTATTATTGATTCCACGACTGGAGGCTTTGAAGCTGGTATCTCCAAAGATGGCCAGACTC GTGAACATGCCCTCCTTGCTTTTACTCTCGGTGTTAAACAGATGATTTGTTGCTGCAACAAGATGGATGCAACTACA CCCAAGTACTCAAAAGCAAGGTATGATGAGATTGTGAAGGAGGTTTCCTCCTACCTCAAGAAGGTTGGTTACAATCC TGATAAGATCCCATTTGTACCAATCTCCGGATTCGAAGGTGACAACATGATTGACAGATCAACCAACCTTGACTGGT
ACAAAGGC。
[0008]所述白及内参基因EF1α的制备方法，采用PCR扩增获得，PCR扩增时，具体引物序列设计如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'。
[0009]所述白及内参基因EF1α在白及中的应用，作为内参基因应用，用于分析评价相关功能基因表达情况，所述功能基因例如为蔗糖合成酶基因（SS）； qRT-PCR分析蔗糖合成酶基因（SS）时，引物序列参考设计如下：
QSSF755:5'- TTTGGGTTATCCTGACACTGGT-3'，
QSSR981: 5'-TCCTGAAGGGAACCCGAAG-3'。
[0010]利用所述白及内参基因EF1α的实时荧光定量PCR检测方法，检测分析时，引物序列设计如下：
QBJEF1aF: 5'-GCCGTCCTTATTATTGATTCCA-3'，
QBJEF1aR: 5'-GGGATCTTATCAGGATTGTAACCA-3'。
[0011]总体而言，本申请首次对白及中的EF1α基因进行了克隆，并对其作为内参基因的功能做了初步研究，结果表明，其可以较好地作为内参基因加以应用，能够较为准确的为相关基因的荧光定量表达分析奠定应用基础，具有较好地实用价值和科研应用价值。
附图说明
[0012]图1 为EF1a基因熔解曲线；
图2为白及EF1a基因在不同发育阶段不同组织的实时荧光定量PCR的荧光阈值；
图3为白及EF1a基因在不同发育阶段不同组织的表达情况；
图4 为EF1a基因实时荧光定量PCR的标准曲线；
图5 为EF1a作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY：幼苗期叶，MG：幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：二年生块茎）；
图6 为TUB作为内参基因用于研究白及SS基因的时空表达特性（图注：MY：幼苗期叶，MG：幼苗期根，1Y：一年生叶，1G：1年生根，1K：一年生块茎，2Y：二年生叶，2G：二年生根，2K：二年生块茎）。
具体实施方式
[0013]下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验背景等情况简要介绍说明如下。
[0014]生物材料：
白及，常见观赏花卉植物，相关材料取自郑州师范学院兰花工程技术中心智能日光温室内；
相关引物序列合成及测序工作由上海英俊生物技术公司提供完成；
实验试剂：
氨苄青霉素、IPTG、X-Gal、DH5α感受态细胞、pMD19-T载体、SYBR® Premix Ex Taq TM
（qRT-PCR用）等，购自TaKaRA公司；
凝胶回收试剂盒、RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒等，购自天根试剂公司； 实验设备：
荧光定量PCR仪 eppendorf realplex2，德国 Biometra公司产品；
微量紫外可见分光光度计（RNA浓度测定用），美国Quawell Q5000。
[0015]实施例1
本实施例主要对白及内参基因EF1α的克隆获得过程简要介绍说明如下。
[0016]（1）RNA的提取及cDNA的合成
分别取白及幼苗期叶和根，一年生的根、块茎、叶，二年生的根、块茎、叶作为样品，随机取三个样品混匀，将样品在液氮中研磨；
参考试剂盒说明书，利用RNAprep多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取不同样品的总RNA，并利用琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取总RNA的完整性；同时，测定总RNA的A260/A280值和A260/A230值，以及测定所提取总RNA浓度。
[0017]电泳检测结果分析表明：28S、18S、5S条带清晰，28S条带的亮度大约是18S的2倍；计算结果表明：OD260/280为1.8～2.1；检测结果表明：总RNA浓度在400-800 ng/µL之间。这些结果表明，所提取总RNA质量较好，提取的总RNA完整性较好，不同样品所提取结果较为稳定和一致，均可用于后续反转录cDNA制备用。
[0018]进一步地，参考说明书，利用RevertAid TM First strand cDNA synthesis Kit 合成制备第一链cDNA，直接应用，或者将所制备cDNA在-20℃条件下保存备用。
[0019]（2）PCR扩增
基于已知的石斛、蝴蝶兰、花生、甘蔗、枸杞等同源DNA保守序列，采用primer5.0设计了1对PCR克隆白及EF1α基因的简并引物序列如下：
EF1aF，5'-ACATCAACATYGTGGTCATTGG-3'，
EF1aR，5'-GCCYTTGTACCAGTCAAGGTTG-3'；
以步骤（1）中所制备cDNA为模板，20μL反应体系设计如下：
10×PCR buffer，2.0 µL；
dNTP(2.5 µmol/L)，1.6 µL；
MgCl2（25µmol/L)，1.5µL；
EF1aF、EF1aR引物(10µmol/L)，各1.0µL；
Taq DNA聚合酶(5U/µL)，0.2 µL；
模板cDNA，1.0 µL；
ddH2O补足至20 µL；
反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30s，59℃复性30 s，72℃延伸40s，33个循环；最后72℃延伸8 min。
[0020]PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，凝胶回收。
[0021]（3）对PCR扩增所得EF1α基因进行鉴定分析
取步骤（2）中回收的PCR扩增产物3.5 µL，按照现有技术，与pGEM-Teasy vector进行连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选后，挑选阳性单克隆进行扩增并进行菌液PCR鉴定，对鉴定正确菌株提取质粒进行测序分析，并进一步进行BLAST分
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