(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911384531.4
(22)申请日 2019.12.28
(71)申请人 河北纳科生物科技有限公司
地址 050035 河北省石家庄市高新区祁连
街95号慧谷大厦A座22层2208
(72)发明人 徐兰举 齐磊 刘鑫 申翠美
杜亚东
(74)专利代理机构 石家庄德皓专利代理事务所
(普通合伙) 13129
代理人 刘磊娜
(51)Int.Cl.
C07K 14/78(2006.01)
C12N 15/12(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
C12N 15/66(2006.01)
C12N 9/02(2006.01)C12N 15/53(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
白及其表达方法
(57)摘要
本发明涉及一种具有功能结构的重组人源
III型胶原蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ
ID NO:3所示，通过与基因序列为SEQ ID NO:4的
羟化酶Hy726共同表达，得到具有三级螺旋结构
的重组人源III型胶原蛋白，该蛋白具有更好的
稳定性和功能性，更能媲美天然人源III型胶原
蛋白生物活性。权利要求书1页 说明书8页序列表4页 附图10页CN 111087464 A 2020.05.01
C N 111087464
A
1.一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，其特征在于，其具有三级结构，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
2.一种参与如权利要求1所述的胶原蛋白表达的羟化酶Hy726基因，其特征在于，其核苷酸序列为为SEQ ID NO:4所示。
3.一种包含如权利要求1所述人源III型胶原蛋白的编码基因和如权利要求2所述的羟化酶Hy726基因的重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230。
4.一种含有如权利要求3所述重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.一种如权利要求1所述的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）基因设计和合成
依据人源III型胶原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向设计基因序列，进行密码子优化，得到人源III型胶原蛋白的编码基因序列SEQ ID NO:3和羟化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，进而根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示基因序列，分别进行全基因合成；
（2）重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建：
a ）将所述人源III型胶原蛋白的编码基因SEQ ID NO:3插入到表达载体PET30a （+）的酶切位点NdeI和XhoI之间，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，挑取阳性克隆，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，得到重组表达载体pET30-1230；
b ）以合成的羟化酶Hy726的原核表达载体pUC -Hy726作为模版，利用高保真PCR技术扩增克隆Hy726片段，PCR产物纯化后以Nco I和BamH I双酶切，得到片段Hy726(N -B)，Nco I和BamH I双酶切pACYCDeut 1空载体，得到片段pACYCDuet 1(N -B)，连接Hy726(N -B)和pACYCDuet 1(N -B) ，连接物转化入感受态细菌，提取质粒，得到载体pACYCDeut 1-Hy762；
c ）将重组表达载体pET30-1230和载体pACYCDeut 1-Hy762分别以Nde I 和Xho I双酶切，得到外源片段1230(N -X)和载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N -X)，连接体系转化DH5α感受态细菌，提取得到重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1230；
（3）转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建
将重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230通过热激转化入感受态细胞BL21(DE3)，筛选获得重组基因工程菌；
（4）诱导表达
将获得的重组基因工程菌接入M9培养基中，37℃培养过夜，再以2%的接种量接种到M9培养基中，23℃培养14h，加入终浓度为0.05mM IPTG进行诱导表达，继续培养12h，离心收集菌体。
6.根据权利要求5所述的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，其特征在于，还包括步骤（5）蛋白纯化：使用磁珠对重组蛋白进行纯化。
权 利 要 求 书1/1页CN 111087464 A
一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白及其表达方法
技术领域
[0001]本发明属于优化编码基因技术领域，具体地涉及一种具有功能结构重组人源III 型胶原蛋白及其原核表达方法。
背景技术
[0002]体胶原蛋白又称胶原，是一种糖蛋白，III型胶原蛋白由三条肽链向右卷曲扭成的三股螺旋状。一级结构分析表明，其多肽链很长的区段序列是由GLy-x-y氨基酸序列重复而成。其中，x通常为脯氨酸，y通常为羟脯氨酸和羟赖氨酸，这种三肽重复序列对胶原蛋白的结构起着很大的作用，特别是成纤维胶原的胶原域是由长而不中断的三股螺旋组成。羟脯氨酸和羟赖氨酸在其他蛋白质中很少见，羟脯氨酸羟基能参与链间的氢键形成，促进三螺旋结构的形成，提高胶原蛋白的稳定性和功能性，对稳定胶原蛋白三螺旋结构并保证其在体温下的热稳定性至关重要。
[0003]胶原蛋白现已被广泛应用于化妆品、医疗器械等领域，用于实现对组织的修复、再生。胶原蛋白的三股螺旋结构对于其实现组织修复功能起着至关重要的作用，同时三股螺旋结构的胶原蛋白比单链的多肽序列要稳定。传统的胶原蛋白主要通过提取的方式从动物组织中获得。然而，动物组织中提取的胶原蛋白存在感染疯牛病等传染性病毒的风险。[0004]现有技术中，虽然对III型人源胶原蛋白的重组技术进行了一些报道，例如CN110194795A公开了一种重组人源胶原蛋白及其应用，选取了人源三
型蛋白保守区域的一段序列并将其重复8次，将设计得到的序列重组构建原核表达载体pET22b中，经过诱导表达，最终得到了能够在大肠杆菌中高效表达的，可溶于水的重组人源胶原蛋白。CN103122027A公开了一种重组人源胶原蛋白及其生产方法，结构为单链结构，基本重复单元为gerga pgf rg pag pngipgekg pagerga p，为人胶原蛋白III型肽段，末端序列为GPPGPCCGGG，为人胶原蛋白II型肽段。尚未有对于重组人源胶原蛋白的功能性三维螺旋结构的技术报道。
[0005]有鉴于此，发明一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白的表达方法尤为重要。
发明内容
[0006]本发明的目的在于提供一种能够提高稳定性的具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，并同时提供其高效的原核表达方法。
[0007]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明一方面提供了一种具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白，其具有三级结构，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。
[0008]本发明还提供了一种参与上述胶原蛋白表达的羟化酶Hy726基因，其核苷酸序列为为SEQ ID NO:4所示。
[0009]本发明还提供了一种包含所述人源III型胶原蛋白的编码基因和羟化酶Hy726基
因的重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230。
[0010]本发明还提供了一种含有所述重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0011]本发明最后一方面提供了一种所述具有功能结构的重组人源III型胶原蛋白原核表达方法，具体包括如下步骤：
（1）基因设计和合成
依据人源III型胶原蛋白氨基酸序列SEQ ID NO:1和巨型病毒 4-脯氨酸羟化酶氨基酸序列SEQ ID NO:2，反向设计基因序列，进行密码子优化，得到人源III型胶原蛋白的编码基因序列SEQ ID NO:3和羟化酶Hy726基因序列SEQ ID NO:4，进而根据SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示基因序列，分别进行全基因合成；
（2）重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建：
a）将所述人源III型胶原蛋白的编码基因SEQ ID NO:3插入到表达载体PET30a（+）的酶切位点NdeI
和XhoI之间，通过热激方法转化到宿主菌E.coli DH5α中，挑取阳性克隆，采用质粒快速提取试剂盒提取质粒，得到重组表达载体pET30-1230；
b）以合成的羟化酶Hy726的原核表达载体pUC-Hy726作为模版，利用高保真PCR技术扩增克隆Hy726片段，PCR产物纯化后以Nco I和BamH I双酶切，得到片段Hy726(N-B)，Nco I和BamH I双酶切pACYCDeut 1空载体，得到片段pACYCDuet 1(N-B)，连接Hy726(N-B)和pACYCDuet 1(N-B) ，连接物转化入感受态细菌，提取质粒，得到载体pACYCDeut 1-Hy762；
c）将重组表达载体pET30-1230和载体pACYCDeut 1-Hy762分别以Nde I 和Xho I双酶切，得到外源片段1230(N-X)和载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X) ，连接体系转化DH5α感受态细菌，提取得到重组质粒pACYCDuet 1-Hy726-1230；
（3）转化体BL21(DE3) / pACYCDuet 1-Hy726-1230的构建
将重组表达载体pACYCDuet 1-Hy726-1230通过热激转化入感受态细胞BL21(DE3)，筛选获得重组基因工程菌；
（4）诱导表达
将获得的重组基因工程菌接入M9培养基中，37℃培养过夜，再以2%的接种量接种到M9培养基中，23
℃培养14h，加入终浓度为0.05mM IPTG进行诱导表达，继续培养12h，离心收集菌体。
[0012]作为本发明的一些实施方案，还包括步骤（5）蛋白纯化：使用磁珠对重组蛋白进行纯化。
[0013]采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
(1)本发明采用基因工程手段获得III型胶原蛋白，避免了动物组织提取胶原蛋白所存在的传播疯牛病等病毒的风险。
[0014](2)本发明获得了具有三螺旋结构的胶原蛋白，其结构与人III型胶原蛋白更相似，具有更好的生物活性。
[0015](5)相对于单链结构胶原蛋白，本发明获得了具有三螺旋结构的胶原蛋白更稳定，便于后期美容、医疗器械等产品的开发和保存。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0017]图1 本发明的Hy726（N-X）的电泳图，图中：1、Hy726（N-X）；2、Marker（DL 2000）；
图2 本发明pACYCDeut 1-Hy762的双酶切鉴定结果图，图中：1、Marker（15K）；2、pACYCDeut 1-Hy762双酶切产物；3、pACYCDeut 1-Hy762双酶切产物；
图3本发明的载体骨架pACYCDuet 1-Hy726(N-X)和外源片段1230(N-X)的鉴定结果图，图中：1、Marker（15K）；2、空白；3、pACYCDeut 1-Hy726（N-X）；4、空白；5、pET30-1230（N-X）；
图4本发明的Nde I单酶切pACYCDuet 1-Hy726-1230鉴定结果图，图中：1、Marker （15K）；2、1#质粒未酶切；3、1#质粒Nde I酶切；4、2#质粒未酶切；5、2#质粒Nde I酶切；6、3#质粒未酶切；7、3#质粒Nde I酶切；8、4#质粒未酶切；9、4#质粒Nde I酶切；
图5本发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的双酶切和单酶切鉴定结果图，图中1、Marker （15K）；2、1#重组子Nde I和Xho I双酶切的质粒； 3、1#重组子未酶切质粒；4、2#重组子Nde I和Xho I双酶切的质粒； 5、2#重组子未酶切质粒；6、1#重组子Nde I单酶切的质粒；7、2#重组子Nde I单酶切的质粒；
图6为发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的诱导表达WB结果图，图中：从左至右，三个泳道依次为1为pET-1230菌株表达的蛋白样品、2为pACYCDuet 1-Hy726-1230的1#菌株表达的蛋白样品、3为pACYCDuet 1-Hy726-1230的2#菌株表达的蛋白样品。
[0018]图7为发明的pACYCDuet 1-Hy726-1230的诱导表达考马斯亮蓝染结果图，图中三个泳道依次为1为pET-1230菌株表达的蛋白样品、2为pACYCDuet 1-Hy726-1230的1#菌株表达的蛋白样品、3为pACYCDuet 1-Hy726-1230的2#菌株表达的蛋白样品。
[0019]图8为本发明的人源III型胶原蛋白的诱导和纯化验证图，图中，1、未诱导；2、诱导；3、Marker；4、未纯化；5、纯化。
[0020]图9为本发明的人源III型胶原蛋白的电镜图；
图10 本发明的重组表达载体pET30-1230图谱；
图11 本发明的重组表达载体pET30-1230的双酶切鉴定结果图，图中：1 Marker（15K）；
2、1#重组表达载体pET30-1230；
3、Nde I和Xho I双酶切1#重组表达载体；
4、2#重组表达载体pET30-1230；
5、为Nde I和Xho I双酶切2#重组表达载体；
6、DL 2000。
具体实施方式
[0021]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
[0022]实施例1 基因设计和合成
（1）基因设计：
根据人源III型胶原蛋白氨基酸序列（UniProtKB/Swiss-Prot: P02461.4），SEQ ID NO：1：
MYDSYDVKSGVAVGGLAGYPGPPGPPPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPG
豫公网安备41160202000603
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