富集材料及制备和生物样品溶液中细胞外囊泡的富集方法

1.本发明属于针对细胞外囊泡富集材料的制备和在不同生物样品溶液中实现细胞外囊泡富集的应用，具体来说将具备超吸附蛋白质和水溶液性质的材料包裹在多孔结构的透析袋材料内部形成富集材料用于生物样品溶液中细胞外囊泡的富集和大体积样品的浓缩。

背景技术：

2.细胞外囊泡是一种从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的具备双层膜结构的囊泡状小体。其直径在30-1000nm之间，在其内部包含许多蛋白质、dna和rna等重要的物质。已有大量的报道显示其在细胞间的交流、信号传导、机体免疫响应等方面扮演着重要的角。同时，由于其来源于母体细胞不易产生免疫排斥和其优越的和膜融合进入细胞的能力被广泛的用于载药领域。此外，利用其蛋白质可以实现多种疾病潜在的生物标志物的发现(文献[1].d.michiel pegtel,et al.annu.rev.biochem.2019.88:487
–
514；文献[2].stefano pluchino,et al.cell.2019.04 04；177(2))。
[0003]
目前对于细胞外囊泡的富集的金标准方法仍是超速离心法，利用其密度与其他干扰物质的差别在超高速离心力(100000g)下实现沉降，但是高的离心力作用会导致囊泡的结构被破坏从而产生低的回收率。依赖聚合物沉降的方式是高回收的进行囊泡富集的方式，但是会产生大量与囊泡共存的蛋白质及其聚合物，这会严重的干扰后续细胞外囊泡的研究。此外，免疫亲和法是利用细胞外囊泡表面存在的特异性的蛋白的结合抗体实现高纯度的分离，特异性较好，但是此方法的成本较高，较难实现高通量处理，同时只能选择性的实现表面表达特异性蛋白的细胞外囊泡的回收。尺寸排阻法是利用细胞外囊泡尺寸与干扰物质差异进行分离的方法，较简单廉价易实现，但是处理体积较大时所用的滤膜容易堵塞且得到的细胞外囊泡回收率低(文献[3].h.shao,et al.chem rev.2018vol.118issue 4pages 1917-1950；文献[4].h.yan,et al.anal chem.2021.03 23；93(11)；文献[5].d.yang,et al.theranostics.2020.vol.10issue 8pages 3684-3707)。
[0004]
因此，为实现高纯度无损的细胞外囊泡的富集，在此发明中，开发一种新型的内核为具备超吸附蛋白质和水溶液性质的聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种，外壳为多孔结构的透析袋材料用于生物样品溶液中细胞外囊泡的富集，此方法不但可以实现共存的污染物的特异性的去除，同时也可以实现大体积样品溶液的浓缩，生物兼容性好，得到的样品可保持活性和完整性直接用于蛋白质组学等领域的分析。

技术实现要素：

[0005]
选择以聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种为内核，表面多孔结构的再生纤维素、聚偏氟乙烯、纤维素酯、聚砜或聚醚砜的透析袋外壳中的一种制备而成的富集材料及其用于不同生物样品中的细胞外囊
泡的富集。
[0006]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0007]
(1)将聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种内核材料与透析袋预先在水中清洗干净。然后将质量为0.1-4000mg之间的内核材料手动的填充到长度为0.5-50cm，宽为1-10cm，表面孔径在5-600nm之间的再生纤维素、聚偏氟乙烯、纤维素酯、聚砜或聚醚砜的透析袋中的一种外壳中。然后对透析袋的口进行密封，保证在反应时候内部包裹的材料不会膨胀溢出，整个材料不会漏。保证此富集材料放在水溶液中时内部的超吸附聚合物材料不漏出，整体的密闭性好；制备好的材料可直接用于生物样品溶液中细胞外囊泡的富集。
[0008]
(2)该材料可以实现生物样品中细胞外囊泡的直接富集，同时也可以实现不同尺寸的细胞外囊泡的分级富集。具体方式如下：
[0009]
将在(1)中制备得到的表面孔径在5-60nm之间的超吸附聚合物材料直接放入到装有生物样品的离心管中，密闭好后，放入4-30℃条件下旋转或静止0.5-30h进行污染蛋白质及水分子的去除。之后在体系中重复1-5次的加入1-10ml的pbs缓冲液进行0.5-10h的清洗反应，反应结束后，超吸附聚合物材料外的溶液即为所需回收的尺寸大于5-60nm细胞外囊泡样品。
[0010]
将在(1)中制备得到的表面孔径在60-200nm之间的富集材料直接放入到装有生物样品的离心管中，与(i)所述的后续操作一致，得到的样品即为尺寸大于60-200nm的细胞外囊泡；
[0011]
将在(1)中制备得到的表面孔径在200-400nm之间的超吸附聚合物材料直接放入到装有生物样品的离心管中，与(i)所述的后续操作一致，得到的样品即为尺寸大于200-400nm的细胞外囊泡；
[0012]
将在(1)中制备得到的表面孔径在400-600nm之间的超吸附聚合物材料直接放入到装有生物样品的离心管中，与(i)所述的后续操作一致，得到的样品即为尺寸大于400-600nm的细胞外囊泡；
[0013]
所富集的不同尺寸的囊泡可直接进行后续的粒径分析，蛋白质表达分析，基于质谱的蛋白质组学分析或者保存在-80℃或者4℃下等待后续的分析。
[0014]
(3)在(2)中得到的样品溶液中加入0.1-2m三(羟甲基)氨基甲烷(tris-hcl)、2-9m尿素、1-8m盐酸胍、质量浓度为0.1-10％十二烷基磺酸钠(sds)、质量浓度0.5-5％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)溶液中的一种或两种以上，超声0-30min，之后加入5-30mm的还原剂二硫苏糖醇(dtt)或者(三(2-羧乙基)膦(tcep))在25-95℃反应5-60min，之后加入10-75mm的碘代乙酰胺(iaa)，在25-40℃下避光反应15-50min，结束后，在室温见光放置10-100min。之后进行自由溶液酶或依赖滤膜辅助的样品处理方法(fasp)中的一种，以胰蛋白酶和lys-c酶的质量比为1:0-1：5混合的酶与原始蛋白量质量比1：10-1：100的量加入,在37℃下反应0.5-24h。得到的溶液进行除盐处理或直接进行后续的质谱分析。
[0015]
(4)从鉴定到的细胞外囊泡的蛋白质组可以分析疾病的潜在的标志物，药物的潜在靶点，影响疾病发生发展的相关过程等。
[0016]
本发明所述的富集材料是由具备超吸附功能的聚合物内核及具有尺寸筛分功能的透析袋外壳组合而成。细胞外囊泡可通过透析袋表面的孔径实现成功的拦截，与其共存
的干扰物如蛋白质由于尺寸较小可以成功通过透析袋被内部的聚合物材料不可逆的吸附，从而实现干扰物质的成功去除。同时由于聚合物材料的强吸水特性可实现大体积样品的浓缩。此种方式可应用于细胞培养液，尿液，血浆等中的细胞外囊泡的富集。
[0017]
本发明具有如下优点：
[0018]
(1)本发明以聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种为内核，多孔结构的再生纤维素、聚偏氟乙烯、纤维素酯、聚砜或聚醚砜的透析袋外壳中的一种为外层，通过表面孔径筛分作用，实现污染物进入材料内部被有效的吸附，同时实现细胞外囊泡的有效的拦截并浓缩。
[0019]
(2)本发明中合成的富集材料的表面孔径在5-600nm之间，可以有效的阻碍细胞外囊泡的进入，而蛋白质尺寸较小，可实现内部有效吸附蛋白及其水溶液。
[0020]
(3)本发明合成的富集材料简单，成本低，表面孔径大小可选择，内部吸附性质可根据富集体系不同随意选择。且生物兼容性好，富集条件温和，不会影响细胞外囊泡的后续应用。
附图说明
[0021]
图1：富集材料结构及富集机理示意图；
[0022]
图2：富集材料处理血浆样品nta图；
[0023]
图3：富集材料处理血浆样品富集细胞外囊泡的western-blotting图；
[0024]
图4：富集材料处理尿液样品nta图；
[0025]
图5：富集尿液细胞外囊泡的蛋白质组分析图；
[0026]
图6：富集材料处理hela细胞培养液样品nta图；
[0027]
图7：富集293t细胞培养液细胞外囊泡的蛋白质组分析图；
[0028]
图8：富集hela细胞培养液细胞外囊泡的蛋白质组分析图；
[0029]
图9：富集hela细胞培养液中大尺寸的细胞外囊泡的蛋白质组分析图。
具体实施方式
[0030]
实施例1
[0031]
富集材料用于血液中细胞外囊泡的富集并用于后续的表征
[0032]
将预先用水洗干净的质量为1mg的聚丙烯酸-丙烯酰胺颗粒(天津希恩思生产，p-68550)装填进入长为1cm，宽为1cm的表面孔径为20nm的再生纤维素透析袋内，将透析袋袋口密封好。200μl血浆样品预先用4000g离心20min去除杂质，得到的样品用pbs缓冲液稀释至0.8ml，置于离心管中，并加入以上获得的富集材料。将离心管放于25℃下的室温，以30秒每圈的速度进行旋转反应，进行4h的吸附后，重复加入1ml pbs缓冲液的再次进行旋转吸附反应2次，每次4h。得到的上清液的样品即为血浆细胞外囊泡。取10μl用pbs缓冲液稀释至1ml进行nta测定粒径。结果如图2所示。富集得到的细胞外囊泡的尺寸集中在14.5-485.5nm之间，平均粒径为111.1nm。同时对富集到的样品通过100kda的滤膜进行离心过滤浓缩，并加入4
×
loading buffer在95℃反应5min的变性，进行细胞外囊泡的特征标志物的western-blotting分析，结果如图3所示。如结果所示，细胞外囊泡的特征标志蛋白质tsg101,cd63显示，且阴性对照蛋白calnexin蛋白不存在。证明血浆细胞外囊泡被成功的富
集。
[0033]
实施例2
[0034]
富集材料用于尿液中细胞外囊泡的富集
[0035]
将预先用水洗干净的质量为20mg的聚丙烯酸钠颗粒(阿拉丁生产，s165277)装填进入表面孔径为20nm长为6cm，宽为4cm的聚偏氟乙烯透析袋内，将透析袋袋口密封好。10ml尿液样品预先用4000g离心20min去除杂质，上清样品通过0.22μm的滤膜去除大颗粒，得到的样品加入以上形成的超吸附聚合物材料。将离心管放于4℃下，以20秒每圈的速度进行旋转反应6h后，重复加入5ml pbs缓冲液再次进行旋转反应3次，每次3h，得到的上清液中的样品即为尿液细胞外囊泡。取20μl用pbs缓冲液稀释至1ml进行nta测定粒径。如图4所示。尺寸范围在22.5-291.5nm之间，平均粒径在100.2nm。
[0036]
取5ml富集得到的细胞培养液中的细胞外囊泡样品，加入终浓度为1m的尿素，超声30min。之后加入终浓度为5mm的dtt,在37℃下反应40min，放至室温后加入终浓度为15mm的iaa,在35℃下避光反应25min，后加入250ng的胰蛋白酶，在37℃下反应1h，酶解后的肽段通过除盐柱除掉盐后，利用200μl的体积浓度80％acn洗脱，冻干后，用30μl的体积浓度0.1％fa复溶后，上q-exactive分析。质谱鉴定830个蛋白，其中650个定位为exocarta库中的外泌体蛋白，85个top100蛋白。富集的蛋白质组分析质谱图如图5所示。
[0037]
实施例3
[0038]
富集材料用于293t细胞培养液中细胞外囊泡的富集
[0039]
将预先用水洗干净的质量为1000mg的聚丙烯酸-丙烯酰胺颗粒(sigma生产，511471)装填进入表面孔径为60nm长为40cm，宽为8cm的纤维素酯透析袋内，将透析袋袋口密封好。80ml 293t细胞培养液预先用4000g离心20min去除杂质，得到的上清样品加入以上形成的超吸附聚合物材料，并将整体材料放于烧杯中。将烧杯放于4℃下，静置反应进行吸附去除20h后，重复加入30ml pbs缓冲液再次进行静置反应10h，得到的上清液中的样品即为293t细胞培养液来源的细胞外囊泡。取100μl细胞外囊泡样品用pbs缓冲液稀释至1ml进行nta测定粒径。如图6所示。细胞外囊泡的尺寸范围在54.5-516.5nm之间，平均粒径在121.4nm。
[0040]
取1ml富集得到的细胞培养液中的细胞外囊泡样品，加入终浓度为质量分数2％的sds，超声10min。之后加入终浓度为5mm的dtt,在37℃下反应60min，放至室温后加入终浓度为10mm的iaa,在35℃下避光反应20min，后利用fasp处理，将放置后的溶液通过截留分子量为30kda的滤膜在14000g离心力下离心过滤除去通过滤膜的物质，过滤后重复3次加入200μl的8mol/l的尿素在14000g离心力下离心40min除去通过滤膜的物质，过滤后再次重复3次加入200μl的50mmol/l的碳酸氢铵溶液在14000g离心力下离心40min除去通过滤膜的物质。最后，加500ng的胰蛋白酶，500ng的lys c酶，在37℃下反应5h，16000g离心40min。冻干后，用15μl的质量分数0.1％fa复溶后，上q-exactive分析。质谱鉴定1030个蛋白，其中850个定位为exocarta库中的外泌体蛋白，75个top100蛋白。富集的蛋白质组分析质谱图如图7所示。
[0041]
实施例4
[0042]
富集材料用于hela细胞培养液中细胞外囊泡的富集
[0043]
将预先用水洗干净的质量为200mg的聚丙烯酸-丙烯酰胺颗粒(sigma生产，
511471)装填进入表面孔径为150nm长为20cm，宽为7cm的聚醚砜透析袋内，将透析袋袋口密封好。20ml hela细胞培养液预先用4000g离心40min去除杂质，得到的上清样品加入以上形成的超吸附聚合物材料。将离心管放于4℃下，静置吸附反应12h后，重复加入40ml pbs缓冲液的再次进行反应3次，每次9h，得到的上清液中样品即为hela细胞培养液来源的细胞外囊泡。取2ml加入终浓度为5m的尿素，加入终浓度为10mm的dtt，在37℃下反应45min，放至室温后加入终浓度为30mm的iaa，在25℃下避光反应30min，后利用fasp处理，利用50mm的碳酸氢铵溶液,每次400μl，16000g离心30min共三次，后加入150μl的50mm的碳酸氢铵溶液，加入200ng的胰蛋白酶，200ng的lys-c酶在37℃下反应12h，16000g离心30min，加入100μl的10mm的碳酸氢铵溶液洗一次，合并冻干后，用10μl的质量分数为0.1％fa复溶后，上q-exactive分析。质谱鉴定832个蛋白，其中525个外泌体蛋白，70个top100蛋白。富集的蛋白质组分析质谱图如图8所示。
[0044]
实施例5
[0045]
富集材料用于hela细胞培养液中大尺寸的细胞外囊泡的富集
[0046]
将预先用水洗干净的质量为60mg的聚丙烯酸钠颗粒(上海金穗生物科技有限公司生产，j43938)装填进入表面孔径为200nm，长为20cm，宽为6.5cm的聚砜透析袋内，将透析袋袋口密封好。30ml hela细胞培养液预先用4000g离心40min去除杂质，得到的上清样品加入以上形成的富集材料。将离心管放于4℃下，吸附去除反应5h后，重复加入10ml pbs缓冲液的再次进行反应3次，每次2h，得到的上清液样品即为hela细胞培养液来源的细胞外囊泡。取1.5ml加入终浓度为6m的盐酸胍，加入终浓度为15mm的tcep，在95℃下反应10min，放至室温后加入终浓度为30mm的iaa,在25℃下避光反应25min，加入50mm的碳酸氢铵溶液将盐酸胍浓度稀释至小于1m,之后加入100ng的胰蛋白酶，100ng的lys-c酶在37℃下反应1h，酶解后的肽段用除盐柱除掉盐后用80％acn洗脱样品，冻干后，用20μl的质量分数0.1％fa复溶后，上q-exactive分析。质谱鉴定722个蛋白，其中525个外泌体蛋白，68个top100蛋白。富集的蛋白质组分析质谱图如图9所示。

技术特征：

1.一种富集材料，其特征在于：富集材料是由超吸附聚合物材料和透析袋组合而成，其中超吸附聚合物材料置于透析袋内；超吸附聚合物材料是指具备吸附水与蛋白质能力极强的聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种或二种以上；利用透析袋将超吸附聚合物材料包裹在其内部即可形成用于生物样品溶液中细胞外囊泡富集的富集材料。2.按照权利要求1所述的富集材料，其特征在于：透析袋是指具有多孔结构的再生纤维素、聚偏氟乙烯、纤维素酯、聚砜或聚醚砜透析袋中的一种或二种以上；制备的富集材料表面透析袋采用的透析膜孔径在5-600nm之间，保证内部材料的填充容量为透析袋容积的1％～70％。3.按照权利要求2所述的富集材料，其特征在于：形成的整体的富集材料或透析袋长度为0.5-50cm，宽为1-10cm，内部材料的填充量在0.1-4000mg之间。4.一种权利要求1或2或3所述的富集材料的制备方法，其特征在于：富集材料制备方法如下：将聚丙烯酸-丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、淀粉丙烯酸盐聚合物、淀粉-丙烯腈接枝共聚物颗粒中的一种或二种以上聚合物材料从透析袋开口处填充到透析袋内部，然后把透析袋袋口密封，即可形成富集材料。5.一种采用权利要求1-3任一所述的富集材料进行生物样品溶液中细胞外囊泡的富集方法，其特征在于：将富集材料与生物样品在容器(如：离心管或烧杯)内在4-30℃条件下旋转或静止0.5-30h进行，保证富集材料全部或部分处于生物样品液面以下；样品中的水及蛋白质通过表面透析袋的孔进入到富集材料内部进行4-30℃条件下旋转或静止0.5-30h的反应被内部的聚合物材料吸附去除，吸附之后在体系中重复1-5次的加入1-10ml的pbs缓冲液进行4-30℃条件下旋转或静止0.5-10h的反应，最终剩余的富集材料外的容器内的溶液即为所需回收的含有细胞外囊泡的样品。6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：在进行大于0到1ml液体中的细胞外囊泡的富集时，内部聚合物材料的质量为0.1-5mg，透析袋的长为0.5-3cm，宽为1-3cm；在进行大于1到10ml液体中的细胞外囊泡的富集时，内部聚合物材料质量为大于5到50mg，透析袋的长为大于3到10cm，宽为大于3到6cm；在进行大于10到100ml液体中的细胞外囊泡的富集时，内部聚合物材料质量为大于50到4000mg，透析袋的长为大于10到50cm，宽为大于6到10cm；在生物样品中加入富集材料即可实现细胞外囊泡的富集。7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述生物样品为人或动物血液、人或动物尿液、人或动物细胞培养液中的一种或二种以上。8.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：获得的含有细胞外囊泡的样品可直接用于后续的应用或保存于4℃或-80℃中；采用上述方法分离得到的细胞外囊泡可用于蛋白质组学研究。
9.按照权利要求5或8所述的方法，其特征在于：将得到的样品溶液中加入0.1-2m三(羟甲基)氨基甲烷(tris-hcl)、2-9m尿素、1-8m盐酸胍、质量浓度为0.1-10％十二烷基磺酸钠(sds)、质量浓度0.5-5％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton x-100)溶液中的一种或两种以上，超声0-30min，之后加入5-30mm的还原剂二硫苏糖醇(dtt)和/或者(三(2-羧乙基)膦(tcep))在25-95℃反应5-60min，之后加入10-75mm的碘代乙酰胺(iaa)，在25-40℃下避光反应15-50min，结束后，在室温见光放置10-100min，得放置后的溶液；之后，按混合酶(胰蛋白酶和lys-c酶质量比为1:0-1:5的混合酶)与得到的样品溶液中蛋白的质量比1：10-1：100的量将混合酶加入放置后的溶液中,在37℃下反应0.5-24h，得到的溶液直接进行后续的质谱分析，或，得到的细胞外囊泡的蛋白质组学可进一步用于后续功能分析；或将放置后的溶液通过截留分子量为10kda或30kda的滤膜在12000-16000g离心力下离心过滤除去通过滤膜的物质，过滤后重复2-4次加入100-400μl的4-8mol/l的尿素在12000-16000g离心力下离心10-90min除去通过滤膜的物质，过滤后再次重复2-4次加入100-400μl的20-100mmol/l的碳酸氢铵溶液在12000-16000g离心力下离心10-90min除去通过滤膜的物质，最后，按混合酶(胰蛋白酶和lys-c酶质量比为1:0-1:5的混合酶)与得到的样品溶液中蛋白的质量比1：10-1：100的量将混合酶加入其中,在37℃下反应0.5-24h，得到的溶液直接进行后续的质谱分析，或，得到的细胞外囊泡的蛋白质组学可进一步用于后续功能分析。10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：从鉴定到的细胞外囊泡的蛋白质组可以分析疾病的潜在的标志物，或药物的潜在靶点，或影响疾病发生发展的相关过程等。

技术总结

本发明涉及一种利用富集材料实现生物样品溶液中细胞外囊泡富集和浓缩的方法。所述的富集材料是由具备超吸附功能的聚合物材料作为内核及具有尺寸筛分功能的多孔结构的透析袋作为外壳组合而成。细胞外囊泡可通过透析袋表面的孔径实现成功的拦截，与其共存的干扰物如蛋白质由于尺寸较小可以成功通过透析袋表面被内部的聚合物材料不可逆的吸附，从而实现干扰物质的成功去除，同时由于聚合物材料的强吸水特性可实现大体积样品的浓缩。此种方式可应用于细胞培养液，尿液，血浆等中的细胞外囊泡的富集。泡的富集。泡的富集。