(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910639291.1
(22)申请日 2019.07.16
(71)申请人 华南理工大学
地址 510640 广东省广州市天河区五山路
381号
(72)发明人 温龙平 钱洁颖
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有
限公司 44245
代理人 苏运贞
(51)Int.Cl.
C07K 19/00(2006.01)
C12N 15/62(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
A61K 47/42(2017.01)
A61K 8/64(2006.01)
C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种透皮重组纤连蛋白及其
应用。本发明的透皮重组纤连蛋白包括如下氨基
纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋
白结合结构域；(Ⅱ)连接肽；(Ⅲ)透皮功能短肽
序列；其中，所述的(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的氨基酸序
列顺次连接。本发明的透皮重组纤连蛋白不仅有
TD -1短肽的重组纤连蛋白相比透皮能力增强十
倍以上，且分子量小，可有效解决DNA重组技术制
备纤连蛋白困难，制备得到的纤连蛋白生物活性
低的技术缺陷。
权利要求书1页 说明书7页序列表5页 附图8页CN 110511280 A 2019.11.29
C N 110511280
A
1.一种透皮重组纤连蛋白，其特征在于：包括如下氨基酸序列：
(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；
(Ⅱ)连接肽；
(Ⅲ)透皮功能短肽序列；
所述的(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的氨基酸序列顺次连接。
2.根据权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白，其特征在于：所述的(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白，其特征在于：所述的(Ⅱ)连接肽为用于构建融合蛋白的连
接肽，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
4.根据权利要求1所述的透皮重组纤连蛋白，其特征在于：所述的(Ⅲ)功能短肽TD -1的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述的透皮重组纤连蛋白在制备促进细胞粘附、伸展、生长及促进透皮吸收药物中的应用。
6.一种编码1-4任一项所述的重组纤连蛋白的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
7.一种遗传构建体，其特征在于：包含权利要求1-4任一项所述的重组纤连蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在表达载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。
8.根据权利要去7所述的遗传构建体，其特征在于：所述的表达载体为pET22b。
9.一种美容组合物，其特征在于：包含1-4任一项所述的透皮重组纤连蛋白。
权 利 要 求 书1/1页CN 110511280 A
一种透皮重组纤连蛋白及其应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种透皮重组纤连蛋白及其应用。
背景技术
[0002]纤连蛋白，英文名称fibronectin(英文缩写FN)，是一种高分子量(约440kDa)的细胞外基质的糖蛋白，它与整合素跨膜受体蛋白结合。与整合素相似的是，纤连蛋白结合了细胞外基质成分，如胶原蛋白、纤维蛋白和肝素硫酸盐蛋白聚糖(如多配体聚糖)。纤连蛋白是一种蛋白质二聚体，由两个几乎相同的单体通过一对c末端的二硫键连接而成。每一个纤连蛋白亚基的分子量为230-250kDa，包含三种类型的模体：I型、II型和III型。这三个模体是由两个反向β-折叠导致Beta折叠；但是，I型和II型是通过链内二硫键稳定的，而III型模体不含任何二硫键。III型模体的二硫键的缺失使其在施用力的作用下得以部分展开。纤连蛋白是由单个基因产生的，但它的前体RNA的选择性剪接导致了几种异构体的产生。这些模体沿着纤连蛋白单体的长度被排列成几个功能性的和蛋白质结合的结构域。纤连蛋白有4个蛋白结构域，允许纤连蛋白与其他纤连蛋白分子结合。其中一个纤连蛋白结构域，I1-5，被称为“装配域”，它是建立纤连蛋白基质组装的必要条件。模体III9-10对应于纤连蛋白的“细胞结合域”。RGD序列(Arg-Gly-Asp)位于III10，它是在细胞表面上通过α5β1和αVβ3整合素的细胞附着位点。这个“增效位点”是在I
II9模体，它可以调节纤连蛋白和α5β1整合素(又称整联蛋白)的增效作用。
[0003]纤连蛋白有许多生物学功能，例如对创面愈合和胚胎发育等过程至关重要。细胞纤连蛋白聚集在细胞外基质中，这是一种不溶性的网络，可以分离和支持有机体的器官和组织。纤连蛋白与纤维蛋白在损伤部位沉积，形成血凝块，止血并保护皮下组织其次，在细胞粘附、伸展、生长、迁移和分化过程中起着重要作用。纤连蛋白在医学、美容化妆品以及科研领域有广泛应用及巨大市场，但从人体或动物血液和组织中提取的天然纤连蛋白产量极为有限，成本昂贵。因此限制了FN在很多方面的应用和生产。此外，皮肤表面有一层物质屏障，阻止了绝大多数蛋白类药物通过皮肤，纤连蛋白为蛋白类分子，透皮能力低，因而在皮肤屏障完整或部分完整情形下应用效果不佳。再者，由于纤连蛋白分子太大，DNA重组技术制备纤连蛋白困难，且得到的纤连蛋白生物活性低。
发明内容
[0004]本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一种透皮重组纤连蛋白。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述透皮重组纤连蛋白的应用。
[0006]本发明的目的通过下列技术方案实现：一种透皮重组纤连蛋白，包括如下氨基酸序列：(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域，纤连蛋白的结构域至少包括纤连蛋白的整联蛋白结合结构域；(Ⅱ)连接肽；(Ⅲ)透皮功能短肽序列；
[0007]其中，所述的(Ⅰ)、(Ⅱ)和(Ⅲ)的氨基酸序列顺次连接。
[0008]优选地，所述的(Ⅰ)至少一个纤连蛋白的结构域的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅰ)所示的氨基酸序列至少有80％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
[0009]优选地，所述的(Ⅱ)连接肽为用于构建融合蛋白的连接肽，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0010]优选地，所述的(Ⅲ)功能短肽TD-1的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸，与(Ⅱ)所示的氨基酸序列至少有90％同源性的，且功能相同或相似的氨基酸序列。
[0011]上述透皮重组纤连蛋白在制备促进细胞粘附、伸展、生长及促进透皮吸收药物中的应用。
[0012]一种编码上述重组纤连蛋白的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。[0013]一种遗传构建体，包含重组纤连蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在表达载体中可操作地与一或多个调控核苷酸序列连接。
[0014]所述的表达载体优选为pET22b。
[0015]一种美容组合物，包含上述透皮重组纤连蛋白。
[0016]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0017]1、本发明截取了纤连蛋白最重要的一部分功能区域，通过连接肽将透皮增强肽TD-1与纤连蛋白连接，得到的透皮重组纤连蛋白具有纤连蛋白的生物学功能及活性，且分子量小，可有效解决DNA重组技术制备纤连蛋白困难，制备得到的纤连蛋白生物活性低的技术缺陷。
[0018]2、本发明的透皮重组纤连蛋白既有促进细胞粘附，伸展及生长的能力，同时还具备比单独纤连蛋白强接近十倍的透皮活性。
附图说明
[0019]图1是本发明实施例提供的思路设计示意图。
[0020]图2是本发明实施例提供的pET22b的说明；其中，a为pET22b的功能区的位置图；b 是pET22b的序列图谱。
[0021]图3是本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的目的片段的结构图；其中，1是质粒泳道，2是用MluI/XhoI酶酶切后的质粒泳道，M是DNA Marker。
[0022]图4是本发明实施例提供的诱导表达及纯化后的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；其中，a是诱导表达的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图；b是纯化后的重组纤连蛋白的SDS-PAGE电泳图。
[0023]图5是本发明实施例提供的内毒素检测的标准曲线。
[0024]图6是本发明实施例提供的HaCat细胞的促细胞粘附，伸展及生长的实验结果图。[0025]图7是本发明实施例提供的PC12细胞的促细胞粘附，伸展及生长的实验结果图。[0026]图8是本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的SD大鼠体外透皮实验结果图。[0027]图9示本发明实施例提供的透皮重组纤连蛋白的SD大鼠体内透皮实验结果图。[0028]图10不同的连接肽连接纤连蛋白与TD-1，比较三者的透皮能力结果图。[0029]图11不同蛋白分子与TD-1重组连接，比较二者的透皮能力结果图；其中，a是TD-1-
IFN-Y的透皮能力结果图，b是FN-TD-1的透皮能力结果图。
具体实施方式
[0030]下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0031]实施例1
[0032]本发明实施例1为获得透皮重组纤连蛋白目的片段和表达载体(本实施例的表达载体标记为：FN-TD-1)，图1是实施例提供的思路设计示意图。使用商用载体pET22b(Code No.VT1200，优宝生物)，见图2(包括pET22b的功能区的位置；pET22b的序列图谱，根据pET22b相关序列位置设计酶切位点；透皮重组纤连蛋白的目的片段的结构)。纤连蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No:1：IQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQL ISIQQYGHQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSI SPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITY GETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT，其核苷酸序列为SEQ ID No:5：ATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGAGACCTAAAAATTC TGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCTGAAGCCTGGTGTG GTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGACTTCACCACCACCA GCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAGACACCATGCGTGT CACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAAAAATGAGGAAGAT GTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGTACAGAATATGTAG TGAGTGTCTCCAGTGTCTACGAACAACATGAGAGCACACCTCTTAGAGGAAGACAGAAAACAGTTTCTGATGTTCC GAGGGACCTGGAAGTTGTTGCTGCGACCCCCACCAGCCTACTGATCAGCTGGGATGCTCCTGCTGTCACAGTGAGA
TATTACAGGATCACTTACGGAGAAACAGGAGGAAATAGCCCTGTCCAGGAGTTCACTGTGCCTGGGAGCAAGTCTA CAGCTACCATCAGCGGCCTTAAACCTGGAGTTGATTATACCATCACTGTGTATGCTGTCACTGGCCGTGGAGACAG CCCCGCAAGCAGCAAGCCAATTTCCATTAATTACCGAACA；在纤连蛋白的C端连接有TD-1，且通过连接肽GGGGS连接。TD-1的氨基酸序列为SEQ ID No:3：ACSSSPSKHCG，其核苷酸序列SEQ ID No: 6：gcttgtagtagcagcccgagcaaacattgcggt。因此，透皮重组纤连蛋白目的片段的氨基酸序列为SEQ ID No:7：MIQWNAPQPSHISKYILRWRPKNSVGRWKEATIPGHLNSYTIKGLKPGVVYEGQLISIQQYG HQEVTRFDFTTTSTSTGSAVPPPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAV VLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTGGGGSACSSSPSKHCG，其核苷酸序列为SEQ ID No:4：ATGATCCAGTGGAATGCACCACAGCCATCTCACATTTCCAAGTACATTCTCAGGTGGA GACCTAAAAATTCTGTAGGCCGTTGGAAGGAAGCTACCATACCAGGCCACTTAAACTCCTACACCATCAAAGGCCT GAAGCCTGGTGTGGTATACGAGGGCCAGCTCATCAGCATCCAGCAGTACGGCCACCAAGAAGTGACTCGCTTTGAC TTCACCACCACCAGCACCAGCACAGGATCTGCTGTTCCTCCTCCCACTGACCTGCGATTCACCAACATTGGTCCAG ACACCATGCGTGTCACCTGGGCTCCACCCCCATCCATTGATTTAACCAACTTCCTGGTGCGTTACTCACCTGTGAA AAATGAGGAAGATGTTGCAGAGTTGTCAATTTCTCCTTCAGACAATGCAGTGGTCTTAACAAATCTCCTGCCTGGT
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