一、目的
1．了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2．掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理
在自然界中，土壤是微生物生活中的最适宜的环境，土壤中存在大量的微生物，但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，因此，为了研究某一微生物的特性，或者要大量地培养和利用某种微生物，必须把它们从这些混杂的微生物中分离出来。从而获得某一菌株的纯培养。这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化
三、器材
1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2．盛有100毫升无菌水的三角瓶，9毫升无菌水的试管，无菌吸管，无菌玻璃涂抹棒，10％的酚液，25％的乳酸，土样，接种环，标签。
四、方法
(一)涂抹平板分离法
1．制备土壤稀释液 称取土样10克，放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中，振摇15—20分钟，使土与水充分混合，将菌分散，静止片刻，用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2．倒平板 将牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基溶化。待冷至50—60℃时，在高氏l号培养基中加入10％酚2滴，在马铃薯蔗糖培养基中加入25％乳酸2滴，然后分别倒平板，每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管，左手拨出棉花塞，试管口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿在火焰附近打开少许，迅速注入培养基，加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布，平放在桌面上，待凝后即成平板。(见图18)。
3．涂抹 将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度，然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液，每一平板注入0.2毫升，再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，静止5分钟。
4．培养 将培养皿倒置，放在28℃温箱培养。
5．移接 将培养后长出的单个菌落分别移接到三种斜面培养基上，28℃下培养，待菌苔长出后检查菌苔是否纯，若有其他杂菌，要进一步进行分离纯化，直到获得纯培养，整个分离过程(见图19)。
图17 接种工具 图18 倒平板
图19 从土壤分离微生物的操作过程
1．倒平板：按上述三种培养基各倒一平板、冷凝。
2．划线：右手拿接种环，从上述10-1的土壤悬液中取一环，左手托培养皿，并在火焰附近打开盖少许，在培养基平板表面轻轻划线，划线方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品进一步在平板上稀释分散，使形成单独的菌落。划线的方法（如图20）
，具体方法如下：
(1)取一环菌样先在平板上划平行线至一半，然后将接种环上剩余菌烧死，培养皿转动90°角，通过第一次平行线划线，划完后盖上皿盖，倒置培养。
(2)取一环菌样后先在平板上作几条平行线，再将培养皿转动70°角。，把接种环上剩余的菌烧死，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行线，再用同法通过第二次平行线作第三次；第四次平行线。划完毕后，盖上皿盖，倒置培养。
图20 划线分离方法
五、实验结果
10^-5浓度 | 细菌 | 放线菌 | 酵母菌 | 霉菌 |
PDA | 7 | 2 | 13 | 2 |
高氏一号 | 1 | 7 | 6 | 1 |
NA | 4 | 2 | 13 | 2 |
| | | | |
六、思考与讨论
1．3-5天后统计3种培养基平板上长出的菌落数，确定最佳稀释浓度。初步判别各培养基上长出的菌落属于分别哪个类？简述它们的菌落形态特征。
最佳的稀释浓度为10^-5培养基长出的菌落分为：放线菌，细菌，酵母菌，霉菌四大类。放线菌的形态特征为干燥，小而紧密，颜多样。细菌的特点是湿，小而突起或大而平坦。酵母菌的特点是较湿，菌落大而突起。霉菌的特点是干燥，菌落大。
2．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？
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