【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化， 根据菌落形态观察及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类。
【关键词】细菌放线菌霉菌划线分离培养基的配制高压蒸汽灭菌 前言：在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中居杂聚。落是不同种类微物的混和体。为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
实验目的：
1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习、掌握微生物的鉴定方法。
3、对提取的土样进行微生物分离、纯化培养，根据菌落的形态特征判断未知菌的类别。实验原理：从混杂的微生物体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。通过如下几种方法可以分离纯化微生物：稀释倒平板法(pour plate method)、涂布平板法(spread plate method)、稀释摇管法(dilution shake culture method)、平板划线分离法(ste sak plate method)。
此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普逼用于微生物的分离与纯化，
其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可
以用肉眼观察其菌落形态。前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。
1.实验器材、试剂与实验方法：
1.1器材：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、H试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、培养皿、自动立式压力蒸汽灭菌器、烘箱、玻璃珠、移液、头、称量纸、药匙、试管架、接种环、酒精灯、超净工作台。 1.2试剂：
牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红、链霉素、1ol/LNaOH、1mol/LHCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O
、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇、75%酒精。
1.3土样：
取自漳州师范学院生物科学与技术系植物园，地下10cm-15cm左右。
1.4实验方法
1.4.1配制培养基：
(一)配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基200ml(用2个100ml三角瓶和2支试管分装)
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普逼的细菌基础培养基。配方如下：牛肉膏0.6g蛋白胨2 g NaCl1g琼脂34g水200mlpH7.4-7.6
1、称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏和蛋白胨可分别放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。
2、加热溶解在烧杯中加入少于所需的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则捋称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，在此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补充所失水分。
3、调pH用pH试纸或酸碱度计检测培养基的pH值，若pH偏酸，可滴加1mol/LNaoH,边加边搅拌，并随时检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol川HCL进行调节。pH调节通常放在加琼脂之前。注意H值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
4、过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。
5、分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用三
角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约试管高度的1/5；分装入三角瓶内的以不超过其容积的一半为宜，半固体培养基以试管高度的1/3为宜。
6、加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的
形状、大小和松紧度要适合，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长3/5塞入试管口或瓶口内，以防止棉花脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。
7、包扎加塞后，将三角瓶的棉花外包一层牛皮纸或双层报纸，以防止灭菌时洽
凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应先把装同类培养基的试管扎成捆后，再于棉花塞外一层牛皮纸。然后用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8、灭菌将上述培养基于121.3摄氏度湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9、摆斜面灭菌后，如制斜面，则需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整
斜度，使斜面的长度不超过试管总长的1/2；待其凝固，
10、无菌检查将灭菌的培养基放入37摄氏度温箱中培养24-48h,无菌生长即可使用。或储存于冰箱或清洁的橱内，备用。
(二)配制高氏一号琼脂培养基200ml(用1个100ml三角瓶和2支试管分装)
高氏一号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。
配方如下：可溶性淀粉4g,KNO30.2g,NaCI0.1g,K2HP04.3H200.1g,
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