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直持诗件吋觅 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月
律广富 '，王永宽2，马 超鳥王玉宝J 林 詰I，钟南方 林 贺I，黄晓巍I * *收稿日期：2020-02-19
基金项目：校企合作项目“小儿治哮灵片安全性评价研究”资助
第一作者：律广富(1984-)，男，助理研究员，主要从事中药药理学研究。E-mail ：*******************通信作者：黄晓巍，女，主任药师，主要从事中药药理研究。E-mail ： 159****************
1. 长春中医药大学，吉林长春130117
2. 吉林敖东延边药业股份有限公司，吉林敦化133700
摘 要：目的 研究小儿治哮灵片对幼年大鼠哮喘模型的干预作用及机制。方法36只雄性Wistar 幼年大鼠随机分为6组： 对照组、模型组、醋酸地塞米松(阳，lmg/kg)组和小儿治哮灵片低、中、高剂量(0.32,0.64,1.28 g/kg)组。除对照
组外，其余各组以卵清蛋白(OVA)致敏、激发制备幼年大鼠哮喘模型。造模第8天开始ig 给药，每天给药1次，给药至 造模3周，对照组和模型组ig 给予蒸憾水。记录各组大鼠引喘潜伏期并进行行为学评分；检测肺脏器指数；酶联免疫吸附 法(ELISA)检测各组幼年大鼠血清中白细胞介素(IL) -4、IL ・5、IL ・6、免疫球蛋白E (IgE)、丫■干扰素(IFN-y)>核转录
因子(NF-k B)的水平以及肺泡灌洗液中IFN *水平。结果与模型组比较，小儿治哮灵片高、中、低剂量组引喘潜伏期及
哮喘行为评分均显著下降(PV0.05、0.01)；肺脏器指数显著下降(PV0.05)；血清IL ・4、IL-5、IL ・6、IgE 、NF-k B 水平均 显著下降(PV0.01)；血清与肺泡灌洗液中IFN-y 水平显著升高(PV0.01)。结论小儿治哮灵片抗哮喘作用可能与降低炎 性细胞因子分泌有关。
关键词：小儿治哮灵片；幼年大鼠；哮喘；肺泡灌洗液；炎性因子；干扰素・丫；核转录因子
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1674・6376 (2020) 12-2434-05
DOI ： 10.7501/j.issn . 1674-6376.2020.12.014
Effect of Xiaoer Zhixiaoling Tablets on asthmatic model of young rats
LU Guangfu 1, WANG Yongkuan 2, MA Chao 1, WANG Yubao 2, LIN Zhe', ZHONG Nanfang 1, LIN He 1, HUANG
Xiaowei 1
1. Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117, China
2. Jilin Aodong Pharmaceutical Group Co., Ltd., Dunhua 133700, China
Abstract: Objective To study the interventional effect and mechanism of Xiaoer Zhixiaoling Tablets on asthmatic model in juvenile rats. Methods Thirty six young male Wistar rats were randomly divided into six groups: control group, model group, dexamethasone
acetate (positive drug, 1 mg/kg) group and low, medium and high dose (0.32, 0.64, 1.28 g/kg) groups of Xiaoerzhixiaoling Tablets.
Expect the blank control group, the other groups of young rats were sensitized by egg albumin (OVA) and stimulated to prepare the rat model of asthma in juvenile rats. On the 8th day of modeling, drugs were ig given once a day until 3 weeks for modeling. The
control group and model group were given distilled water. The incubation period of asthma was recorded and the behavior score was
evaluated. The levels of IL-4> IL-5、IL-6> IgE 、IFN -丫、NF-k B in serum of young rats and the level of IFN-y in alveolar lavage were detected by enzyme-linked immunosorbent method. Results Compared with the model group, the asthma latency and asthma
behavior scores in the high, middle and low dose groups of Xiaoer Zhixiaoling Tablets were significantly decreased (P < 0.05 and 0.01), and the lung organ index was significantly decreased (P < 0.05); levels of IL-4, IL-5, IL ・6, IgE, NF-k B decreased in the high-
dose group, the medium-dose group and the low-dose group (P < 0.01), and levels of IFN-y in serum and alveolar lavage fluid increased (P < 0.01). Conclusion The anti-asthma effect of Xiaoer Zhixiaoling Tablets; may be related to the decreased secretion of
downstream inflammatory cytokines.
Key words: Xiaoer Zhixiaoling Tablets; juvenile rat; asthma; alveolar lavage; inflammatory factors; IFN-y; NF-k B
名拎；钳吋总Drug Evaluation Research第43卷第12期2020年12月•2435・
支气管哮喘是世界上最常见的慢性病之一，是以咳嗽、喘息、胸闷和气促反复发作为主要临床表现的慢性气道炎症和气道高反应性特征的异质性疾病，常在夜间和清晨发作或加剧，呼吸道症状的具体表现形式和严重程度随时间变化而改变，并常伴有可逆性呼气气流受限
我国哮喘发病人数逐年上升，特别是儿童患者。儿童免疫力低，当外界环境剧烈变化时，易感受外邪从而引发哮喘。小儿哮喘是儿科的常见病、多发病，常反复发作，很难完全治愈。如果儿童期不能得到有效地，很容易发展为成人哮喘，对小儿身体健康及生长发育有很大影响。调查显示，我国儿童哮喘的总患病率已达3%以上，哮喘已成为危害中国儿童健康成长的主要慢性疾病之一⑵。
小儿治哮灵片具有止哮、平喘、镇咳、化痰、强肺、脱敏等功效，用于小儿哮、咳、喘等症的，多年来临床小儿哮喘具有较好的疗效本实验采用幼年大鼠作为研究对象，对小儿治哮灵片作用机制进行探讨，为提高药品质量和保障患者用药安全，提供理论依据。
1材料
1.1动物
健康雄性4周龄幼年大鼠，36只，体质量（85土5）g，购于长春市亿斯实验动物有限公司，实验动物
生产许可证号SCXK（吉）-2018-0003。
1.2主要试剂
小儿治哮灵片（吉林敖东延边药业股份有限公司，批号1010001，规格0.1g/片）；醋酸地塞米松片（遂成药业股份有限公司，批号H41021038，规格0.75mg/片）；卵清蛋白（OVA,Sigma，货号SLBS6919）；氯化钠注射液（吉林省都邦药业股份有限公司，批号H22023069），白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-6、免疫球蛋白E（IgE）、核转录因子（NF-k B）和y-干扰素（IFN-y）酶联免疫试剂盒（江苏酶免实业有限公司）。
1.3主要仪器
JSC-202超声雾化器（辽宁鞍山电子医疗仪器厂）；电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；WP-UP-III-40精密型超体纯水机（四川沃特尔科技发展有限公司）；4°C低温离心机（CerrtrifUge 5810R）：恒温培养箱（EYEL4SLI-700，上海爱朗仪器有限公司）:MultiskanFC型酶标仪（赛默飞世尔（上海）仪器有限公司）。2方法
2.1分组及给药⑷
将36只幼年大鼠随机分为6组：对照组、模型组、醋酸地塞米松（1mg/kg，阳）组和小儿治哮灵
片低、中、高剂量（0.32、0.64、1.28g/kg）组，每组6只。自造模第8天开始ig给药，给药体积10mL/kg，对照组和模型组给予等体积蒸馅水，给药至造模第3周。
2.2哮喘模型的制备炉〕
除对照组外，大鼠适应性饲养1周后开始造模，于第1天ip1mL10%OVA溶液（含100mg OVA）致敏，在第4、7天再次ip10% OVA溶液1mL，以加强致敏；第8天开始将大鼠置于自制的雾化箱给予5%OVA溶液雾化激发，每天1次，每次30min，共激发3周。对照组致敏时ip相同剂量生理盐水，激发时则采用相同剂量蒸憾水雾化激发。
2.3行为学评价
将5%OVA溶液放入雾化器内，打开雾化器开关，同时开始计时，记录各组大鼠引喘潜伏期。参照文献建立评分标准"陶：①无明显呼吸急促，0分；呼吸频率加快，未见鼻翼扇动，腹式呼吸,0.5分。②呼吸困难（鼻翼扇动、腹式呼吸），1.0分；呼吸困难伴轻咳，1.5分。③呼吸困难，并出现咳嗽、哮鸣（少于3次/min）,2.0分；呼吸困难濒繁咳嗽（大于3次/min）,2.5分。④张口呼吸，或深长呼吸，呼吸暂停伴眼、耳、唇紫纟甘，3.0分；站立不稳，3.5分。⑤休克、跌倒不起、猝死,4.0分。
2.4血清的采集
第28天最后1次雾化后，ip3%钠（40mg/kg）进行麻醉。去除下腹部皮毛，剪开皮肤，用棉花分离暴露血管，左手用蹑子夹住近心端血管，右手持5mL1次性注射器插入腹主动脉取血（如果抽吸过程中，抽动困难，转动注射器使空气进入可继续抽动），放入5mL离心管中，3500r/min 离心10min，取上清液分装冻存于-20七冰箱，待用吧
2.5肺泡灌洗液的采集及肺脏指数的检测
去除颈部皮毛，剪开皮肤，钝性分离气管（注意避开颈部血管），于接近头端的气管剪一切口，左手大拇指压住头部，食指压住胸部，剩余3指从下拖住颈部。右手持带有灌胃针的2.5mL注射器，缓慢注入PBS缓冲液1mL，静置10s后，轻轻按压胸部，将缓冲液回抽，置于5mL离心管中，重复操作6次（回
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名乂诵侍环总 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月
收率大于80%)，肺泡灌洗液以3 500 r/min 离心 10 min，取上清液分装冻存于-20。(：冰箱，待用
取大鼠肺脏，称质量，计算肺脏指数。
2.6酶联免疫吸附法检测
酶联免疫吸附法检测血清中IL-4、IL-5、IL-6、
IgE 、IFN-Y 、NF-KB 水平以及肺泡灌洗液中IFN -丫水
平。以上检测操作均严格按照酶联免疫试剂盒说 明书进行。
2.7统计学方法
应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计 量资料以7七表示，比较采用r 检验。
3 纟吉果
3.1小儿治哮灵片对大鼠哮喘行为的影响
造模后，与对照组比较，模型组大鼠哮喘行为 评分均显著升高(PV0.01)；给药后，与模型组比较， 阳和小儿治哮灵片高、中、低剂量组引喘潜伏
期显著延长，哮喘行为评分显著下降(PV0.05、
0.01)»结果见表1。
表1小儿治哮灵片对大鼠哮喘行为的影响(x±s,”=6)
Table 1 Effect of pediatric treatment of Xiaoer
Zhixiaoling Tablets on asthma behavior in rats(x±5, w=6)
与对照组比较:^<0.01；与模型组比较：・PVO.O5 "PV0.01
**P v 0.01 vs control group : *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group 组别剂量/
(g kg ')引喘潜伏期/S
行为学评分
对照——0±0模型
—
87.23±2.45 榊
3.01±0.3 严
醋酸地塞米松0.001163.22±15. 53"1」8±0.62"
小儿治哮灵片
1.28148.91±9.54“ 1.58±0.43•“0.64139.07±16.73“
2.03±0.27"
0.32
105.38il0.63
** 2.21±0.81
* 3.2小儿治哮灵片对大鼠肺脏指数的影响
与对照组比较，模型组大鼠肺脏指数显著升
高(P<0.05)；与模型组比较，阳和小儿治哮灵 片高、中、低剂量组肺脏器指数显著下降(P<0.05)。 提示小儿治哮灵片能够改善OVA 造成的哮喘模型 大鼠气道炎症引发的肺部炎症反应，缓解肺损伤的
作用。结果见表2。
表2小儿治哮灵片对大鼠肺脏器指数的影响(x±s,n =6)
Table 2 Effect of pediatric treatment of Xiaoer Zhixiaoling Tablets on lung organ index in rats(x±s,w=6)
与对照组比较：炉V0.05；与模型组比较:・PVO.O5 *P < 0.05 vs control group ； *P < 0.05 vs model group
组别 剂>/(g-kg')体质量/g
肺脏指数/%
对照—29&02±13.420.86±0.06模型—
274.20±1 &45
0.94±0.07"
醋酸地塞米松0.001282.42±15.890.85±0.06*小儿治哮灵片
1.28
297.25±11.59
0.83±0.04*0.64289.08±16.45
0.86±0.07*0.32286.00±15.00
0.84±0.06
*3.3小儿治哮灵片对大鼠血清和肺泡灌洗液中炎
性因子水平的影响
与对照组比较，模型组血清中IL-4、IL-5、IL-6、
IgE 、IFN-Y 、NF-KB 的水平均显著升高(PV0.01)，血
清和灌洗液中IFN-y 水平显著降低(P<0.01)；与模
型组比较，阳和小儿治哮灵片高、中、低剂量组 血清中IL-4、IL-5、IL-6、IgE 、NF-k B 的水平均显著降
低(P<0.01)，血清和灌洗液中IFN-y 水平均显著升 高(P<0.01)。结果见表3和4。
4讨论
儿童哮喘己成为儿童三大慢性疾病之一，儿童
患者因年龄较小，脾肾不足，难以生成和运化水津；
表3小儿治哮灵片对大鼠血清中炎性因子的影响G±s 』=6)
Table 3 Effect of pediatric treatment of Xiaoer Zhixiaoling Tablets on inflammatory factors in rat serum (%±s ,m =6)
组别
剂量/
(g kg ')IL-4/(ng-L ')
IL-5/(ng L ')IL-6/(ngL')IgE/(ng L ')IFN-y/(ng L ')NF-KB/(ng-L ')对照—13.8U1.9319.26±1.66
15.66±2.8252.46±5.66
471.07±25.66565.7U27.90模型
—31.81i2.41**40.35^2.89^29.27±3.5 萨97.88±7.81^291.45il9.36**708.93±39.81 榊醋酸地塞米松0.001
17.38i3.08
**21.26±3.20"20.32±1.49“
61」3±8.49“
391.51±16.41"
537.14±22.43“
小儿治哮灵片
1.2818.44±
2.01"2
3.49±2.79"19.67±2.12"62.06±9.85"377.85i22.92**576.00±25.49“
0.6419.65±2.53"
24.93±2.40"21.92±1.41"70.85±6.97"
367.43i25.89**600.86±90.63"0.32
22.67±3.02"26.54±3.44"
24.25±1.73"
79.39±5.02"
327.85±29.12“
642.19±127.04"
与对照组比较:^<0.01；与模型组比较:"PVO.01 ttu P < 0.01 vs control group : **P< 0.01 vs model group
名畑杓吋总 Drug Evaluation Research 第43卷第12期2020年12月
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表4小儿治哮灵片对大鼠肺泡灌洗液中IFN *的影响(兀土
5, w=6)Table 4 Effect of pediatric treatment of Xiaoer
Zhixiaoling Tablets on IFN-y in alveolar lavage fluid of
rats(%±5,n=6)
与对照组比较：傑<0.01；与模型组比较:"PV0.01
胖P < 0.01 vs control group ； **P < 0.01 vs model group
组别剂量/(g ，kgT)
IFN-y/(ng-L *)对照—801.43±54.40模型—
519.29i26.23
**醋酸地塞米松
0.001809.76±41.64"小儿治哮灵片
1.28
832.80±34.0r *0.64
775.48±38.3 广0.32
697.86±29.31”
肺脏娇弱，肺之宗气不足难以通调水道以散布水 津。水津运化失常，于肺中内湿为痰。痰浊反作用
影响肺的宣发肃降，宗气难以走息道以司呼吸，气 促发为哮喘，哮喘当以祛痰、散寒、温肺3步入
手。难根治、易复发的哮喘特点严重影响了儿童的 身心健康发展。如果不及时，易成为伴随一生 的疾病。小儿治哮灵片具有燥湿以祛内因之痰、解
表以散外因之寒、温肺以助肺之宗气的作用，适用 于小儿哮、咳、喘等症的g 诃。
现代医学认为哮喘的发病机制为辅助性T 淋巴 细胞l(Thl)功能不足，机体出现以辅助性T 淋巴细
胞2(Th2)占主导的Thl/Th2失衡，产生大量的IL-4、
IL-5JL-6，并进一步促进IgE 的活化和聚集，IgE 大
量增加后通过与效应细胞相应受体结合后，刺激效 应细胞产生能使支气管平滑肌收缩的白三烯等炎 症介素，最终诱发以气道炎症和气道高反应性为特
征的哮喘。Thl 细胞主要分泌IFN-y 等细胞因子，哮 喘患者体内IgE 合成过多的主要原因是IFN-y 分泌
减少，其中IFN-y 具有加强宿主防御和参与免疫调
节的作用。IFN-y 是IgE 的负调节因子，能抑制由
IgE 引起的炎症反应，在机体中作为保护因子。而
哮喘患者IFN-y 分泌减少的主要原因则是由NF-k B 信号通路过度激活引起，外部刺激使无活性状态的
NF-k B 从细胞质中进入细胞核活化，促进基因转录,
从而增加下游炎性细胞因子水平，加速了哮喘发生
与发展皿“呵。本实验采用IL-4、IL-5、IL-6、IgE 、
IFN-y.NF-k B 作为检测指，以探讨小儿治哮灵片对
幼年大鼠哮喘模型的干预机制。实验结果表明，哮 喘大鼠模型血清中IL-4、IL-5、IL-6、IgE 、NF-k B 较对
照组显著增高，血清和肺泡灌洗液中IFN-y 较对照
组显著降低。提示血清中IL-4、IL-5、IL-6、IgE 、IFN-
Y ，NF-k B 以及肺泡灌洗液中IFN-y 与OVA 诱导的哮
喘大鼠密切相关。大鼠哮喘模型的发作机制可能 是OVA 诱导NF-k B 信号通路激活，导致下游炎性细 胞因子过度分泌，IgE 合成增加，从而引起炎症级联
反应。经过小儿治哮灵片干预后，各给药组的IL-4、
IL-5、IL-6、IgE 、NF-k B 水平较模型组均显著降低,
IFN-y 较模型组均显著升高。结果表明，小儿治哮
灵片干预后能够改善哮喘症状，其作用机制可能为 抑制哮喘大鼠肺组织中NF-k B 活化通路，调节下游
炎性细胞因子水平的分泌，还原Thl/Th2正常比值，
进而降低炎性反应的进程，从而起到哮喘的 作用⑴如。
小儿治哮灵对幼年大鼠哮喘模型具有较好治
疗作用。儿童哮喘作为儿科的主要慢性疾病之一， 严重影响了儿童的健康成长。而中医药儿童
哮喘具有很好的疗效，本实验为儿童患者用药安全
提供了理论依据，同时为防止儿童哮喘提供了新的
思路。
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