孙凯鑫1,2，王友元1,2，石丽颖1,2，李前庆1,2，刘红羽1,2，赵静1,2，王军1,2*，吕文发1,2*
（1.现代农业技术教育部国际合作联合实验室，吉林长春 130118；
2.动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118）
摘 要：为探究致病性大肠杆菌（EPEC）诱导的子宫内膜炎的损伤机制，将24只8~10周龄、体重30~35 g 的雌性小鼠随机分为4组，每组6只，3个炎症模型组分别使用留置针向小鼠子宫内灌注1×106、1×108、1×1010 CFU/mL的大肠杆菌25 μL，对照组向小鼠子宫内灌注等体积的生理盐水。24 h后进行剖检，通过观察组织病理学变化、ELISA检测细胞炎性因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及炎症通路核因子κB（NF-κB）的水平。结果表明：1×1010 CFU/mL大肠杆菌可使子宫内膜层与肌层无明显界限，中性粒细胞浸润情况增加（P<0.05），促进IL-6、IL-1β和TNF-α的表达（P<0.001），促进炎症通路NF-κB的激活（P<0.05）。综上，使用1×1010 CFU/mL大肠杆菌灌注小鼠子宫24 h可成功建立子宫内膜炎模型，为进一步探究由大肠杆菌诱导的子宫内膜炎的损伤机制提供理论依据。 关键词：子宫内膜炎；大肠杆菌；炎性因子；小鼠
中图分类号：S852.3 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20201124-04
子宫内膜炎是因子宫内膜感染而引起的炎症，会延迟繁殖周期并降低动物的生产能力，对养殖业造成巨大的经济损失[1-2]。产后生殖道扩张，细菌等病原微生物感染均可导致子宫内膜炎发生，其中细菌感染是子宫内膜炎发生的主要诱因[3-4]。大肠杆菌是引起子宫内膜炎的常见致病菌，其作为革兰氏阴性菌，外壁层包含着大量脂多糖，而脂多糖是炎性细胞的主要激活物，可诱导中性粒细胞激活，导致炎性细胞因子的产生与释放[5]。炎症反应的特征主要包括炎性介质和细胞因子的大量产生，而细胞因子中促炎和抗炎的稳态失衡，导致炎症持续性产生并使组织破坏引起疾病[6]。研究表明，炎症介质的产生受核因子κB（NF-κB）的影响[7]。NF-κB 信号通路激活可通过上调促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达来调节炎症反应[8-9]。为进一步探究大肠杆菌诱导小鼠子宫内膜炎症的发生，本研究向小鼠子宫内灌注致病性大肠杆菌（EPEC）建立小鼠子宫内膜炎模型，并通过检测组织病理学变化、炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α及NF-κB蛋白表达以验证模型是否建立成功，进一步探究大肠杆菌诱导的子宫内膜炎的损伤机制，为子宫内膜炎的提供一定研究基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物本试验选择8~10周龄、体重30~35 g 的SPF级健康ICR雌性小鼠24只，购自辽宁长生生物技术股份有限公司，动物生产许可证号：SCXK（辽）2020-0001。
1.2 试验仪器微量移液器（10~100 μL，德国 Eppendorf）、石蜡切片机、分析天平（ME104E，梅特勒）、恒温恒湿箱（HPX-160BSH-III，上海新苗医疗器械制造有限公司）、光学显微镜（BA410E，Motic Europe）、超净工作台（HS-840u，苏州净化设备有限公司）、实时荧光定量PCR仪（Mx3000P，上海吉泰生物科技有限公司）、梯度PCR仪（Veriti，Thermo Fisher Scientific）。
1.3 细菌培养致病性大肠杆菌（EPEC）由本实验室
收稿日期：2020-11-24；修回日期：2020-12-30
资助项目：国家重点研发计划（2018YFD0501600）；国家自然基金（31672420）；吉林省中青年科技创新领军人才及团队（20200301031RQ）
作者简介：孙凯鑫（1997-），女，山东临沂人，硕士，主要从事繁殖生物技术研究，E-mail：*****************
*通讯作者：吕文发，男，教授，博士研究生导师，E-mail：*****************；王军，男，教授，博士研究生导师，E-mail：*******************
提供。将冻存的大肠杆菌放至室温，用接种环蘸取菌液在LB固体培养基上连续划线，恒温箱37℃培养24 h 后用接种环挑取单菌落于LB液体培养基中培养8 h，纯化3次后予以备用。
1.4 子宫内膜炎模型的建立将24只小鼠经过适应性喂养7 d后，随机分为4组，每组6只，3个炎症模型组分别使用留置针向小鼠子宫内灌注1×106、1×108、1×1010 CFU/mL的大肠杆菌25 μL，对照组向小鼠子宫内灌注等体积的生理盐水，灌注24 h后将所有小鼠剖检并进行采样。
1.5 病理组织切片染剖检小鼠，取小鼠子宫角中段使用4%多聚甲醛固定1周，埋在石蜡中制作石蜡切片，进行切片、脱蜡、水化和染等过程制作HE染切片，光学显微镜下观察各组小鼠子宫组织的病理变化。
1.6 荧光定量PCR 根据NCBI查并设计小鼠的IL-6、IL-1β和TNF-α序列引物，均由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息见表1。Trizol法提取小鼠子宫组织的RNA，按照TaKaRa试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，荧光定量PCR检测IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达。荧光定量PCR反应体系：10 μL SYBR Premix Ex Taq II、6 μL ddH2O、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，0.4 μL ROX reference Dye II，2 μL cDNA模板。反应条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火34 s，95℃复性15 s，扩增40个循环。
1.7 酶联免疫吸附实验小鼠子宫内膜炎炎症模型建立完成后，收集小鼠子宫，进行组织研磨。取1 g组
织，加入9 mL的pH为 7.2~7.4的PBS，用手工或者匀浆器将标本匀浆充分。离心20 min（2 000~3 000 r/min），仔细收集上清。按照ELISA说明书进行操作，检测细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的变化，试剂盒为江苏酶免实业有限公司提供。1.8 Western Blot测定NF-κB蛋白表达取小鼠子宫组织称重0.1 g研磨，BCA 法测定各组样品蛋白浓度。使用SDS-PAGE电泳缓冲液将蛋白条带跑开以获得目的蛋白，使用转膜液将蛋白转移到PVDF膜上（250 V、0.12 A、28 min）。将膜与封闭缓冲液37℃封闭2 h，加入一抗p65（1:1 000；Invitrogen）、p-p65（1:1 000；Invitrogen）、IκBα（1:1 000；Invitrogen）、p-IκBα（1:1 000；Invitrogen）、β-actin（1:10 000；Invitrogen）37℃孵育1.5 h。TBST 缓冲液洗涤3次后再加入二抗37℃孵育1 h，TBST缓冲液洗涤3次。最后使用Tanon Gis 软件进行蛋白条带的灰度值分析。
1.9 统计与分析利用GraphPad Prism 5.0软件对试验所得数据进行单因素方差分析，结果均表示为平均值±标准误，P>0.05表示无统计学差异，P<0.05为差异显著，P<0.01和P<0.001为差异极显著。
2 结果与分析
2.1 炎症模型小鼠子宫组织HE染小鼠子宫组织HE染结果显示（图1），对照组小鼠的子宫组织结构正常，子宫内膜层与肌层界限分明，内膜间质细胞排列整齐，腺体大小均一，分布均匀，腺上皮及宫腔上皮完整。在1×106、1×108 CFU/mL大肠杆菌感染组中发现，子宫内膜层与肌层界限不清，腺体
、宫腔上皮缺失，宫腔残余面积狭小。而在1×1010 CFU/mL大肠杆菌感染组中，小鼠子宫内膜层与肌层无明显界限，子宫内膜浅层上皮、腺腔和宫腔内形成微脓肿和中性粒细胞浸润。
2.2 荧光定量PCR检测模型小鼠炎性因子的mRNA表达如图2所示，使用1×106 CFU/mL大肠杆菌灌注小鼠子宫24 h后，与对照组相比，1×106 CFU/mL组炎性因子IL-6和TNF-α的基因水平显著上升，1×108 CFU/mL组IL-6和TNF-α的基因水平极显著上升，1×1010 CFU/mL 组IL-6、IL-1β、TNF-α基因水平极显著上升。
2.3 ELISA检测模型小鼠炎性因子的分泌如图3所示，
A ：对照组；B：大肠杆菌：1×106 CFU/mL ；C：大肠杆菌：1×108 CFU/mL；D：
大肠杆菌：1×1010 CFU/mL。
图1 不同浓度的大肠杆菌对小鼠子宫组织HE染比较（×100）
表1 引物信息
基因引物序列（5'→3'）片段大
小, bp
退火温
度,℃
IL-6F：CCACTTCACAAGTCGGAGGCTTA
R：CCAGTTTGGTAGCATCCATCATTTC
16960
IL-1βF：TCCAGGATGAGGACATGAGCAC
R：GAACGTCACACACCAGCAGGTTA
10560
TNF-αF：TATGGCCCAGACCCTCACA
R：GGAGTAGACAAGGTACAACCCATC
19960
β-actin F：GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG R：ATGCCACAGGATTCCATACC 174
A B C D
与对照组相比，向子宫内灌注1×106 CFU/mL 的大肠杆菌模型中IL-1β的分泌水平上升（P <0.001），IL-6和TNF-α分泌水平无变化。向子宫内灌注1×108 CFU/mL 的大肠杆菌后，IL-1β和TNF-α分泌水平上升（P <0.01），IL-6的分泌水平无显著变化。使用1×1010
CFU/mL 的大肠杆菌24 h 后，IL-6（P <0.01）、IL-1β（P <0.001）和TNF-α（P <0.01）3种炎性因子的分泌水平均上升。2.4 小鼠子宫组织中NF-κB 炎症通路相关蛋白的表达通过蛋白质免疫印迹实验检测小鼠子宫组织内的蛋白变化发现，大肠杆菌处理激活了NF-κB 通路，I κB-α与p65的磷酸化水平上升（P <0.05），NF-κB 的活性被显著激活，p-p65/p65（P <0.01）和p-I κB-α/I κB-α（P <0.05）表达量与对照组相比均上升（图4）。
A ：各组子宫组织中NF-κ
B 通路相关蛋白表达水平，B ：p-p65/p65的蛋白表达水平，
C ：p-I κB-α/I κB-α的蛋白表达水平。
图4 炎症模型小鼠对NF-κB 信号通路表达的影响
图3 炎症模型中炎性因子的蛋白分泌水平的变化
与对照组相比，*表示P <0.05，**表示P <0.01，***表示P <0.001。下图同。
图2 炎症模型中炎性因子的基因表达水平
A
B
C
A
B
C
I L -6 m R N A 表达量
I L -6, p g /m L
I L -1β, p g /m L
T N F -α, p g /m L
I L -1β m R N A 表达量
T N F -α m R N A 表达量
6
4
2
6
4
2
8
64
2
30
20
10
20
15
105
543210
对
照
组
对
照
组
对
照
组
对
照
组
对
照
组
对
照
组
1×10
6
1×10
6
1×10
6
1×10
6
1×10
6
1×10
6
1×10
8
1×10
8
1×10
8
1×10
8
1×10
8
1×10
8
1×10
10
1×10
10
1×10
10
1×
10
10
1×10
10
1×10
10
*
**
***
***
***
***
**
**
*
*
***
**
***
***
*
A
B
C
对照组 炎症组
对
照
组
对
照组炎
症
组
炎
症
组
p65
p-p65
I κB α
p -I κB α
β-actin
P -P 65/P 65
p -I κB α/I κB α
1.51.00.50.0
1.51.00.50.0
3 讨论
子宫内膜是分娩后抵御生殖道感染的第一道防线，主要发挥屏障作用[10-12]。细菌感染通常会促进免疫细胞的聚集并导致子宫的急性炎症[13]。大肠杆菌诱发的子宫损伤呈典型的炎症反应，子宫组织有严重的炎性反应，其特征是有脓肿形成和出现大量的白细胞浸润[14]。本研究参考以往动物子宫内膜炎模型的建立方法[15-16]，向小鼠子宫内灌注1×1010 CFU/mL致病性大肠杆菌24 h 后，通过检测组织切片、炎性因子和炎症通路的变化来确定炎症发生，成功建立了小鼠子宫内膜炎的病理模型。
炎症是对病原体或内源性信号分子释放的先天免疫应答的重要组成部分[17]。许多促炎细胞因子、趋化因子和黏附因子的产生被认为与疾病过程中的炎症有关[18-19]。IL-6、IL-1β和TNF-α等促炎细胞因子在产后早期子宫内膜炎的发生中发挥重要作用[20]。IL-6是感染和组织损伤后迅速产生的，它通过刺激急性期反应，造血作用和免疫反应来促进宿主防御[21]。白介素-1（IL-1）家族由几种促炎或抗炎蛋白组成，其中最主要的炎症介质是IL-1β，可通过与IL-1的受体1结合而导致发烧和免疫活化[22]。TNF-α是与TNF受体1（TNFR1）结合时的关键促炎性细胞因子[23]。本试验中，利用1×1010 CFU/mL 的大肠杆菌灌注小鼠子宫24 h后IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平显著性上升，说明大肠杆菌能够引起炎症相关细胞因子的合成释放，从而导致子宫炎症的发生。
NF-κB转录因子家族被认为是炎症过程的主要介质，是先天性和适应性免疫反应的关键参与者。在众多转录因子中，NF-κB是调节促炎性产生的最重要因子[24]。NF-κB在炎症反应过程中对促炎介质的调节中起关键作用，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2[25-26]。据报道，NF-κB是调节涉及免疫和急性期炎症反应的各种因子表达的关键转录因子[27]。本研究中，大肠杆菌增加了p-p65/p65的蛋白水平，这表明大肠杆菌加强了NF-κB的核转运；大肠杆菌感染后子宫组织中p-IκB-α蛋白水平升高，p-IκB-α/IκB-α显著高于对照组，这表明大肠杆菌激活了IκB-α向p-IκB-α发生转变。本研究结果显示，在小鼠子宫内膜炎模型中，与对照组相比，大肠杆菌能够通过引起细胞中的NF-κB活化来增加促炎性介质产生，与相关研究报道一致[28-29]。以上研究表明大肠杆菌能够激活细胞中的NF-κB来引起炎症反应。4 结论
本试验结果表明，使用浓度为1×1010 CFU/mL 的大肠杆菌25 μL灌注小鼠子宫24 h后，可诱导小鼠的子宫发生炎症，成功建立小鼠子宫内膜炎模型。
参考文献：
[1] Sheldon I M, Cronin J, Goetze L, et al. Defining postpartum
uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle[J]. Bio Reprod, 2009, 81(6): 1025-1032.
[2] Jana B, Jaroszewski J J, Czarzasta J, et al. The influence of
leukotrienes C and D on the contractility of an inflamed porcine uterus[J]. Theriogenology, 2015, 83(8): 1328-1337.
[3] Soper D E. Bacterial vaginosis and postoperative infections[J].
Am J Obstet Gynecol, 1993, 169(2 Pt 2): 467-469.
[4] Andrews W W, Hauth J C, Cliver S P, et al. Association of
asymptomatic bacterial vaginosis with endometrial microbial colonization and plasma cell endometritis in nonpregnant women[J]. Am J Obstet Gynecol, 2006, 195: 1611-1616. [5] Li W, Fu K, Lv X, et al. Lactoferrin suppresses lipopolysa-
ccharide-induced endometritis in mice via down-regulation of the NF-κB pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2015, 28: 695-699.
[6] Neurath M F. Cytokines in inflammatory bowel disease[J]. Nat
Rev Immunol, 2014, 14: 329-342.
[7] Bak M J, Hong S G, Lee J W, et al. Red ginseng marc oil
inhibits iNOS and COX-2 via NFκB and p38 pathways in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages[J]. Molecules, 2012, 17(12): 13769-13786.
[8] Kyriakis J M, Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein
kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation[J]. Physiol Rev, 2001, 81(2): 807-869.
[9] Lee J C, Kassis S, Kumar S, et al. p38 mitogen-activated protein
kinase inhibitors--mechanisms and therapeutic potentials[J].
Pharmacol Ther, 1999, 82(2-3): 389-397.
[10] Shen Y, Liu B, Mao W, et al. PGE(2) downregulates LPS-
induced inflammatory responses via the TLR4-NF-κB signaling pathway in bovine endometrial epithelial cells[J]. Prostag-landins Leukot Essent Fatty Acids, 2018, 129: 25-31.
[11] Koyama T, Omori R, Koyama K, et al. Optimization of dia-
gnostic methods and criteria of endometritis for various postpartum days to evaluate infertility in dairy cows[J]. Therio-genology, 2018, 119: 225-232.
[12] Herath S, Lilly S T, Santos N R, et al. Expression of genes
associated with immunity in the endometrium of cattle with disparate postpartum uterine disease and fertility[J]. Reprod Bio Endocrinol, 2009, 7: 55.
[13] Herath S, Fischer D P, Werling D, et al. Expression and function
of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus[J].
Endocrinology, 2006, 147(1): 562-570.
[14] Schmitz J M, Tonkonogy S L, Dogan B, et al. Murine adherent
and invasive e. coli induces chronic inflammation and immune
responses in the small and large intestines of monoassociated IL-10-/- mice independent of long polar fimbriae adhesin A[J]. Inflamm Bowel Dis, 2019, 25(5): 875-885.
[15] 刘雅枝, 喻翌, 符铭雪, 等. 大鼠子宫内膜炎模型的建立及
炎症因子水平的检测[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2016, 32(12): 54.
[16] 孙海英, 孙龚, 孙佰军, 等. 复合微生态制剂对子宫内膜
炎家兔模型的效果研究[J]. 中国微生态学杂志, 2016, 28(6): 659-661.
[17] Rauch I, Müller M, Decker T. The regulation of inflammation
by interferons and their STATs[J]. Jakstat, 2013, 2(1): e23820.[18] Turner M L, Cronin J G, Healey G D, et al . Epithelial and
stromal cells of bovine endometrium have roles in innate immunity and initiate inflammatory responses to bacterial lipopeptides in vitro via Toll-like receptors TLR2, TLR1, and TLR6[J]. Endocrinology, 2014, 155(4): 1453-1465.
[19] Ye G Y, Wang K Y, Gui Q D, et al . Ureaplasma urealyticum-derived lipid-associated membrane proteins introduce IL-6, IL-8, and TNF-α cytokines into human amniotic epithelial cells via Toll-like receptor 2[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2018, 19: 654-661.
[20] Brodzki P, Kostro K, Brodzki A, et al . Inflammatory cytokines
and acute-phase proteins concentrations in the peripheral blood and uterus of cows that developed endometritis during early postpartum[J]. Theriogenology, 2015, 84(1): 11-18.
[21] Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. IL-6 in inflammation,
immunity, and disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 6(10): a016295.
[22] Yazdi A S, Ghoreschi K. The Interleukin-1 family[J]. Adv Exp Med Biol, 2016, 941(2): 21-29.
[23]
Philip M, Rowley D A, Schreiber H. Inflammation as a tumor promoter in cancer induction[J]. Semin Cancer Biol, 2004, 14(6): 433-439.
[24] Tak P P, Firestein G S. NF-kappaB: a key role in inflammatory diseases[J]. J Clin Invest, 2001, 107(1): 7-11.
[25]
Fan G, Jiang X, Wu X, et al . Anti-inflammatory activity of
tanshinone IIA in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages via miRNAs and TLR4-NF-κB pathway[J]. Inflammation, 2016, 39: 375-384.
[26] Zhai X T, Zhang Z Y , Jiang C H, et al . Nauclea officinalis inhibits
inflammation in LPS-mediated RAW 264.7 macrophages by suppressing the NF-κB signaling pathway[J]. J Ethnopharmacol, 2016, 183: 159-165.
[27] Ruland J. Return to homeostasis: downregulation of NF-κB
responses[J]. Nat Immunol, 2011, 12(8): 709-714.
[28] Altman R, Motton D D, Kota R S, et al . Inhibition of vascular inflammation by dehydroepiandrosterone sulfate in human aortic endothelial cells: roles of PPARalpha and NF-kappaB[J]. Vasc pharmacology, 2008, 48: 76-84.
[29] Jeon S, Hur J, Kim J. DHEA alleviates oxidative stress of
muscle cells via activation of Nrf2 pathway[J]. Appl Biochem Biotechnol, 2015, 176(1): 22-32.
（责任编辑：周会会）
of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease[J]. Nature, 2014, 513(7519): 569-573.
[17] Guo M, Ren K, Zhu Y, et al . Structural insights into a high fidelity variant of SpCas9[J]. Cell Res, 2019, 29(3): 183-192. [18] Anders C, Bargsten K, Jinek M. Structural plasticity of PAM
recognition by engineered variants of the RNA-guided endon-uclease cas9[J]. Mol Cell, 2016, 61(6): 895-902.
Construction and Efficiency Verification of CRISPR/Cas9 System without PAM Restrictions
QIN Huaiyuan, LI Hegang, ZHANG Ning, XIN Jingjing, ZHAO Jinshan *
（College of Animal Technology Qingdao Agricultural University, Shandong Qingdao 266109, China ）
Abstract: The targeted gene knockout, transcriptional activation, and suppression of the CRISPR /Cas9 system require specific targeted gene editing by identifying a prospacer adjacent motif (PAM) sequence at the Cas9 target site. At this stage, the widely recognized Streptococcus pyogenes SpCas9 only recognizes the relatively short PAM as NGG. In this experiment, on the basis of wild-type SpCas9, xCas9 and SpCas9-NG with PAM as NG, the mutants SpCas9NNG with expected PAM as NNG and xCas9NNN and ngCas9NNN with expected PAM as NNN were constructed through the dual luciferase reporter gene. Test to evaluate its cutting activity. The final result shows that the ngCas9NNN mutant constructed in this experiment has significant cleavage activity for the target DNA whose PAM is NNN, which provides an important reference for the subsequent expansion of the target range of the CRISPR / Cas9 system.Keywords: CRISPR/Cas9; No PAM restrictions; Variants; Gene editing
（责任编辑：赵 楠）
[19] Walton R T, Christie K A, Whittaker M N, et al . Unconstrained
genome targeting with near-PAM less engineered CRISPR-Cas9 variants[J]. Science, 368(6488): 290-296.
[20] 辛京京, 李和刚, 秦怀远, 等. CRISPR/AsCpf1双切刻系统
构建初探[J].中国畜牧杂志, 2020, 56(12): 1-13.
[21] 耿德玉, 原媛, 郭华荣. 双荧光素酶报告基因系统的应用研
究进展[J]. 科技资讯, 2012(21):
（上接第194页）
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议