摘要：本文主要介绍了乳糖酶的理化性质及分类，分离纯化方法，酶活力测定方法，还介绍了乳糖酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展。 ABSTRACT: This article mainly introduced physical and chemical properties, classification,the methods of separation and purification,the determination method of the enzyme activity,and also introduced application and the latest research progress of β-galactosidase in food and pharmaceutical field.
关键词：乳糖酶 分离纯化 研究现状 应用
KEY WORD: β-galactosidase Separation and purification Research status Application
前言：乳糖酶(lactase)也称为β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。乳糖酶分布广泛，理化性质稳定，催化能力强，使得它在食品和医药领域有着广泛的应用，特别是在医药领域中，乳糖酶能够水解乳糖成半乳糖和葡萄糖，促进牛奶的被人体更好的吸收和利用以“乳糖不耐症”。当前，乳糖酶的固定化和基因方面的研究也相当热且研究成果显著。这里介绍乳糖酶一 些基本的理化性质，分离纯化和酶活力测定方法，还有乳糖酶在食品﹑医药上的应用及其最新研究进展，通过这些介绍使得人们对乳糖酶有更加清晰和全面的认识。
1乳糖酶概述
1.1乳糖酶分布
乳糖酶(lactase)称为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶(β-D-galactohydrolase)，简称β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。
乳糖酶广泛地存在于扁桃、桃、杏、苹果和咖啡豆等植物中；大肠杆菌、乳酸杆菌、酵母菌和霉菌等微生物中，以及有效哺乳动物的小肠等器官和皮肤组织中[1]。现在商业上所有的β-半乳糖苷酶都来源于微生物发酵法，基本上由酵母和霉菌发酵获得。 1.2 乳糖酶分类
乳糖酶根据不同来源可分为胞内酶或胞外酶[2],如乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根酶等产乳糖酶均为胞外酶,脆壁克鲁维酵母和大部分细菌产胞内酶。
1.3 乳糖酶基本理化性质及作用机理
乳糖酶属于糖基水解酶家族的一员，分子量在54万左右，是一个四聚体三维结构，在酶系谱中的编号为EC3．2．1．23。乳糖酶是一种白粉末、无味道、无嗅，溶解后是一种浅棕液体且无毒无副作用的生物酶制剂。该酶可用于降解乳糖为半乳糖和葡萄糖,亦具有半乳糖苷的转移作用。产该酶的微生物的作用的最适pH范围较广（pH3~7）[3]，微生物乳糖酶最适作用温度范围较宽,酵母乳糖酶作用温度在35℃左右,而霉菌最适作用温度一般在50℃以上,最高可达60 ℃,环状芽孢杆菌则可达65℃,嗜热水生菌则为80℃,耐高温微生物菌株使用时可避免杂菌污染。
早期的研究表明[4,5],B2半乳糖苷酶上的CyS的巯基和His上的咪唑基对B2半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用[6]。根据推测, 巯基使得糖苷键的氧原子质子化,而咪唑基作为亲和试剂进攻糖基的C,形成一个含碳-氢键的共价中间物。在半乳糖基被切割下米之后, 巯基阴离子从水分子抽取一个质子,从而形成OH2 进攻C。在反应的各个步骤, 异头碳的构型没有变化。因而,由乳糖酶催化水解的产物仍然保持原来的B2构型。近来的研究认为乳糖酶的催化机制与溶菌酶类似。即有一基团作为碳提供一个质子给糖苷键的氧原子, 另一带负电的基团可能
通过形成过渡态的共价键来稳定中间过渡物糖苷上带正电的碳原子。过程为:酶+乳糖酶y乳糖(1)酶-乳糖y半乳糖苷-酶+葡萄糖(2)半乳糖苷-酶+受体y半乳糖苷-受体+酶(3)反应第3步酶将B2半乳糖苷酶转移给含羟基的亲核受体。当受体是水则生成半乳糖,受体是糖则生成二糖、三糖和其他相应的半乳糖苷低聚糖。这些产物反过来又可以作为底物被酶缓慢水解。因此,乳糖的水解反应可视为是半乳糖苷转移反应的特殊情况,即以水作为半乳糖苷的受体。在大多数情况下,由于反应体系中水的高浓度使水解反应占主导地位,低聚半乳糖的生成量很少。
2 乳糖酶分离纯化及活力测定方法[7]
2.1 材料与方法
2.1.1 原料与试剂
2.1.1.1 菌种
脆壁克鲁维酵母( Kluyeveromyces fragilis) 由哈尔滨商业大学食品工程学院保藏。
2.1.1.2 培养基主要成分
斜面培养基: 葡萄糖、酵母粉、琼脂粉；
种子培养基: 葡萄糖、酵母粉；
发酵培养基: 乳糖、酵母粉。
2.1.1.3 主要化学试剂
乳糖、邻硝基酚β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、酵母粉。
2.1.2 方法
2.1.2.1 种子培养
取适量斜面菌种接种于种子培养基中, 摇床培养: 30 ℃, 180 r/min, 培养24 h。
2.1.2.2 液态发酵培养
将培养好的种子培养液按10%量接种于液态发酵培养基中。发酵条件:摇床培养28℃,180r/min,培养36h,初始pH7-7.5。
2.1.2.3 粗酶液制备
发酵培养物经4000 r/min离心15 min,倾去上清液, 向沉淀的酵母细胞加入一定量的pH7.0磷酸盐缓冲液,搅拌均匀后,用球磨180r/min作用60min,再加入一定倍数的pH7.0磷酸盐缓冲液,搅拌均匀后离心弃去酵母细胞残片,即可得到粗酶液待测。
2.2 酶活力测定方法
2.2.1 测定原理
邻硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)为易溶于水的无化合物,β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成邻硝基苯酚(ONP),ONP在中、碱性范围呈黄,在420nm有最大吸收峰。
2.2.2 标准曲线
分别取50、100、150、200、250、300、350、400、450、500μL浓度为5μmol/mL的ONP溶液加入试管中,加去离子水至5mL,以去离子水为空白,在分光光度计420nm比。以ONP浓度为横坐标,OD420为纵坐标绘制标准曲线。
2.2.3 测定方法[8]
向试管中加入2.8mL,pH7.0磷酸盐缓冲液,40℃恒温水浴预热后,加入100μL,浓度为4mg/mL(ONPG)溶液和100μL粗酶液,40℃恒温反应5min后,于420nm比,根据标准曲线和测定的OD值计算ONP含量。1mL酶液1min催化ONPG水解生成1μmol邻硝基酚(ONP)定义为一个酶活力单位。
3 乳糖酶的应用
3.1 乳糖酶在食品领域上的应用
3.1.1分解乳糖，解决乳糖不耐症
乳糖酶在食品领域上的应用主要是将乳糖酶添加到乳制品中，分解乳糖，解决乳糖不耐症。牛乳是一种重要的饮食资源，含有多种人体健康所必需的营养成分，是新生婴儿的主要食品。从20世纪60年代以来，科学家们相继发现儿童和成年人因体内缺乏可以分解乳糖的乳糖酶，在摄入牛乳后，乳糖不被分解而是直接进入肠道，易引起腹鸣、腹胀、腹痛、呕吐、腹泻等所谓的“乳糖不耐症”
[9]，限制了他们从牛奶中获得人体所需的营养物质。在牛乳中添加乳糖酶就可以水解乳糖成半乳糖和葡萄糖，使牛乳更好的被人体吸收和利用。
3.1.2促进果蔬成熟及软化
β－半乳糖苷酶普遍存在于各种食物中，了解β－半乳糖苷酶在果蔬各个生长时期的含量，对于果蔬的成熟、风味、颜、组织及采收后加工都有重要意义。现今，β－半乳糖苷酶已用于梨、苹果、土豆和中国水粟的软化和番茄、胡椒、甜瓜、樱桃核果和牛油果的成熟。
3.2 乳糖酶在医药领域上的应用
3.2.1 生成低聚半乳糖GOS(galoctooligosaccharide)
低聚半乳糖是以高浓度的乳糖作为β－半乳糖苷酶的底物而生成的，GOS的研究是国内外发展乳糖酶的最热门的用途，之所以说这个研究在国内外最热门，是由于GOS具有特殊的生理功能：1)它是“双岐杆菌的增值因子”，只能为双岐杆菌，而不能为肠道中的腐败菌所利用；2)GOS属于低分子量水溶性的膳食纤维，具有优于普通膳食纤维的特点；3)是低热值糖，可在低能量食品中发挥作用；4)低龋齿性，GOS不能被突变链球菌(Streptocollusmuta
nts)等口腔细菌利用；5)改善血清脂肪代谢，降低总血清胆固醇浓度，提高血清中脂蛋白所占比例；6)有利于产生B族维生素、尼克酸、叶酸等；7)改善矿物质元素的吸收作用，促进钙质吸收和防止骨质减少，同时使肠道对Na的吸收有降低的倾向[10]。
3.2.2 合成和修饰其他碳水化合物
利用酶的选择性来实现复杂碳水化合物的区域定向和立体走向合成，比主流的化学方法要简便，操作清洁温和，近年来成为发展方向。利用β－Galactosidase的糖苷转移作用人工合成糖苷化合物，这对食品添加剂、药品和其他生理活性物质的合成有潜在意义。用固定化
的β－半乳糖苷酶催化合成的中等链长的醇基－糖苷表面活性剂，已成为食品乳化剂的重要一族。
3.2.3 在酶工程和医药方面的应用
乳糖酶用于免疫分析只有无源性干扰，底物无致癌性且显稳定，与荧光底物相结合可作超微量荧光酶分析，对微量激素药物的定量分析，以及病毒、单科隆抗体等测定具有灵敏
的特点。
4 乳糖酶应用的最新研究进展
4.1 乳糖酶固定化[11]
乳糖酶水解乳糖为半乳糖和葡萄糖，可缓解乳糖不耐症。固定化乳糖酶极易与底物分离，可较长时间进行反复分批反应和装柱反应，提高酶稳定性，且利于过程控制，产物中无酶的残留，能简化提纯工艺；固定化乳糖酶与游离酶相比更适合多酶反应，使用效率更高，成本降低。酶的固定化方法有非共价结合法、化学结合法和包埋法[12]。由于使用不同载体和固定化方法，往往得到不同的效果。国外早在1972年就有对乳糖酶进行了固定化研究[13]。近年来国内也做了大量的研究。李文英等[14]用聚丙烯酰胺凝胶固定米曲霉来源的乳糖酶，稳定性好。潘道东等[15]用κ-卡拉胶包埋法固定化脆壁酵母乳糖酶，能有效地水解乳清、脱脂乳和全乳中的乳糖。固定化酶与游离酶相比有很多优点，可保持其高效专一性，且催化温和，利于保存。固定化乳糖酶可使操作连续进行，简化生产工艺，提高酶的利用率。固定化乳糖酶的应用主要通过酶反应器实现。
4.1 半乳糖苷酶基因的克隆与在微生物中的表达
在大肠杆菌中的克隆和表达因大肠杆菌的遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、易于操作等的特点,半乳糖苷酶基因大都在大肠杆菌中克隆和表达得到的酶都比在原来的菌株中的酶的活力高。刘爱兵[5]等以乳酸克鲁维斯酵母(Kluyvero2myces lactis) 菌株k528的基因组DNA为模板,用TapPlus 酶PCR扩增乳糖酶基因,获得重组质粒T1549,经SnaB I、NotI双切,B2半乳糖苷酶基因插入到表达载体pET230a( 经EcoRÕ、NotI双酶切)上构建重组表达质粒pETlac4,将pETlac4电击转化到大肠杆菌BL21中表达, 经酶活测定,比酶源菌产生的酶活提高1.5倍[16]。
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