国际生物制品学杂志 2()2()年12 月第 43 卷第 6 期Int J Biologicals，December 2()2(>，Vol. 43，No. 6
鲁卫卫^孟繁岳2郭会杰1郝春生1毛颖3高帆3卞莲莲3段凯4陈晓琦4
李新国4陈伟5陶红2张良豪5陈金华4李秀玲
鲁卫卫和孟繁岳对本文有同等贡献
1国药中生生物技术研究院有限公司第二研究室，北京u m i i;2江苏省疾病预防控制中 心疫苗临床评价所，南京210009; 3中国食品药品检定研究院肝炎病毒室，北京102629; 4武汉生物制品研究所有限责任公司科研开发部430070; 5武汉生物制品研究所有限责任 公司医学事务部430070; 6上海生物制品研究所有限责任公司201403
通信作者：李秀玲，Email: 189****************
【摘要】目的观察肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71)疫苗接种后5年的免疫持久性。方 法在DI期临
床试验免疫原性亚组中，对完成全程两针次免疫的、免前抗EV71中和抗体阴性人进行 免疫后5年采血，并检测抗EV71中和抗体评价免疫持久性。完整检测时间点包括0、56 d和8、14、26、64个月。采用t检验和卡方检验分析数据。结果疫苗组和安慰剂对照组分别有235和255名受试 者具有全部检测点的中和抗体数据。接种后64个月，疫苗组抗EV71中和抗体几何平均滴度（369. 57) 高于对照组(55. 58)，且差异有统计学意义(t= 14. 28,P<0. 01)；分别以抗体滴度8、16、32为阳性判定 标准，疫苗组抗体阳性率（l〇〇%、99. 57%、97. 87%)均高于对照组（69. 02%、61. 96%、59. 61%)且差异 有统计学意义(；1；2分别为1〇7.93、133.14、130.69，_?值均<0.()1)。疫苗接种后其他检测时间点的结果 与64个月类似。结论该EV71疫苗两针基础免疫后能够诱导较高的中和抗体水平和阳性率，在免 疫后5年依然保持较好的免疫持久性。 【关键词】肠道病毒71型灭活疫苗；中和抗体；免疫持久性
基金项目：国家科技重大专项“重大新药创制”(2016ZX09101120)
临床试验注册：美国临床试验注册平台，NCT01508247
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20200706-00074
Five-year immunity persistence following immunization with inactivated enterovirus 71 vaccine (Vero
cell) Lu Weiwei1 , Meng Fanyue2 , Guo H uijie1, Hao Chunsheng', Mao Qunying3, Gao Fan3，Bian Lianlian3, Duan K ai4 , Chen Xiaoqi4, Li Xinguo4 , Chen Wei5 , Tao Hong2 , Zhang Lianghao5 , Chen Jinhua4，Li X iiding6
Lu Weivuei and Meng Fanyue contributed equally to the article
1 No.
2 Research Department National Vaccine& Serum Institute, Beijing 101111 , China；2Institute o f Clinical Evaluation o f Vaccines»J iangsu Provincial Center fo r Disease Control and Prevention , Nanjing 210009, China; 3Hepatitis Virus Research Department，National Institutes fo r Food and Drug Control，Beijing 102629，China; 4Research and Development Department，Wuhan Institute o f Biological Products Co.，L td.，Wuhan 430070，China; 3Medical A ffa ir s Department，Wuhan Institute o f Biological Products Co.，L td.，Wuhan 430070，China; 6Shanghai Institute o f Biological Products Co.，L td.，Shanghai 201403，China
Corresponding author:Li X iiding，Email: 189****************
【Abstract】Objective To investigate the 丨mmunity persistence five-year post vaccination of inactivated enterovirus 71 (EV71) vaccine. Methods Among the immunogenicity cohort in phase IE
•261••论著•
• 262 •国际生物制品学杂志 2()20 年12 月第 43 卷第 6 期Im J Biologicals，December 2020, Vol. 43, No. 6
trial, blood samples were collected from a subset of participants having fulfilled 2-dose vaccination
protocol,and whose serum EV71 neutralizing antibody (NAb) assay was negative on day 0. NAb was
tested to evaluate immunity persistence. The full series of sampling time points included days 0 and 56, as
well as months 8，14，26，and 64. Data were analyzed by /-test and chi-square test. Results There were
235 subjects in vaccine group and 255 in placebo control group who had full series of sampling points
results. At 64-month post vaccination, the geometric mean titer (GMT) of anti-EV71 NAb in vaccine
group (369. 57) was higher than that in control group (55. 58)，and the difference was statistically
significant = 14. 28, P <0. 01). By the cutoff NAb titer values of 8, 16, 32, at month 64, the
seropositive rates in vaccine group (100%, 99. 57%, 97. 87%) were higher than those in control group
(69. 02%，61. 96%，59. 61 %)，and the differences were statistically significant (chi-square values were
107. 93, 133. 14, 130. 69, respectively；all P values <0. 01). The results at other observed time points
post vaccination were similar with those at month 64. Conclusion The EV71 vaccine induces a sustained
high level of NAb GMTs andseropositive rates against EV71 for at least 5 years.
【Key words】Inactivated enterovirus 71 vaccine；Neutralizing antibody；Immunity persistence
Fund program：National Science and Technology Major Project for 44Major New Drug Innovation and
Development （2016ZX( )91 () 112())
Trial registration：v, NCT01508247
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-2()2()0706-()0074
肠道病毒 71 型（enterovirus 71，EV71)属小 R N A病毒科肠道病毒属A型，是引起手足口病的 主要病原体之一[1]。EV7〗主要感染6月龄〜3岁婴幼儿，能引发多种临床症状，少数可引起严重并发 症[2]。近年来，手足口病已成为全球性传染病，给流 行国家和地区带来沉重的社会经济负担。目前尚无 有效的EV71感染所致疾病药物，因此EV71 疫苗的研发至关重要。
全球范围内已有3种EV71疫苗上市，但有关 疫苗的长期免疫持久性数据较少。国药中生生物技 术研究院有限公司和武汉生物制品研究所有限责任 公司联合研发的e v7i疫苗在I一 m期临床试验中 显示了较好的安全性、免疫原性和有效性[>5]。免疫 后1年内对EV71感染所致手足口病保护效力为9().93%，对EV71所致的住院或重症病例的保护效 力达10()%™。免疫后2年内对手足口病、疱疹性 口腔炎和疱疹性咽峡炎等相关疾病保护率为%.57%[7]。该EV W疫苗于2016年被批准上市，目前正在进行IV期临床研究以观察其在大规模人中 接种的安全性和保护效力。
本研究对DI期临床试验中EV71疫苗免疫后5 年内血清中抗EV71中和抗体水平变化情况进行观 察，以初步评价免疫后5年的免疫持久性。
1材料与方法
1.1疫苗和免疫程序
本次试验所使用的疫苗为含铝佐剂EV71灭活疫苗(V ero细胞），每剂320 U/0. 5 m l，由武汉生物 制品研究所有限责任公司生产，疫苗株为FY7VP5/ AH/CHN/2008 (C4亚型，基因库注册号：JXU25561)。安慰剂对照为不含EV71抗原的铝佐 剂。抗原含量由中国食品药品检定研究院以EV71 抗原国家标准品为标准进行测定。受试者按()、28 d 两针次免疫程序接种，12〜35月龄受试者接种于上 臂三角肌，6〜11月龄受试者接种于大腿前外侧。1.2试验设计
本研究是在6〜35月龄的健康人中进行的一 项随机、双盲、安慰剂对照的IK期临床试验，于2012 年1月至2013年3月在中国4个研究中心(江苏省 东海县、邳州市、宝应县和北京市朝阳区）开展。受 试者共10 245名，随机抽取1 200名作为免疫原性 亚组人在第一针免疫后〇d、56 d、8个月、14个 月、26个月采血，并对其免疫原性和免疫持久性进 行评价。此项研究仅对免疫原性亚组中免前阴性人 进行采血检测抗EV71中和抗体，并且进行免疫 持久性评价。
江苏省东海县、邳州市和宝应县三个研究中心 人组受试者疫苗组436人、对照组55()人为免前阴 性，在本项研究中，免疫原性亚组的614名免前阴性 受试者完成了第一针免疫后5年血清采集，并送中 国食品药品检定研究院检测抗E V71中和抗体，评 价接种后5年免疫持久性。
本试验获得了江苏省疾病预防控制中心的伦理
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• 263 •
委员会的批准，受试者的监护人均签署了知情同意 书，并由江苏省疾病预防控制中心在赫尔辛基宣言 和临床试验管理规范的指导下实施本次临床研究。 1.3中和抗体检测
采集免疫原性研究亚组中免前阴性受试者血 清，送中国食品药品检定研究院，用文献[8-9]微量 细胞病变法检测抗EV 71中和抗体。1.4统计方法
采用SPSS 17.()软件对结果进行统计分析，受 试者人口学年龄和性别分布分别采用Z 检验和卡方 检验，抗体滴度经对数转换进行z 检验，中和抗体阳 性率比较采用卡方检验，P <〇. 05为差异有统计学 意义。血清抗体水平的阳性界值定为8，同时分别 以8、16、32为血清阳性标准进行血清阳性率的统计 分析，中和抗体滴度<8和>1 024的检测值分别以4 和1 ()24进行统计。
2
结果
2.1受试者人口学
共614名受试者完成首针免疫后5年免疫持久 性血样采集并获得抗EV 71中和抗体检测结果，其 中490名受试者同时具有(）d 、56 d 、8个月、14个 月、26个月、64个月抗EV 71中和抗体检测数据，疫 苗组和对照组分别为235和255名，疫苗组和对照 组年龄分布(《 = (). 92,P = (). 92)和性别分布（f 二 0.
68，P = 0. 41)均衡可比，见表1。2. 2
免疫后5年抗EV 71中和抗体滴度
E V 71疫苗免疫后第56天和8、14、26、64个 月，疫苗组的抗E V 71中和抗体几何平均滴度 (geometric mean titer ,G M T )均高于对照组，且差 异有统计学意义G 值分别为57. 53、31. 36、38. 45、 23.39、14. 28;P 值均<0. 01)。由各检测时间点检 测结果可知，E V 71疫苗接种后的5年内抗E V 71中 和抗体G M T 水平较为稳定，接种后8个月GMT 下降约50%，在26个月显著增高；随着时间的推 移，对照组抗E V 71中和抗体G M T 增高，26个月后
增高较为明显，但仍低于疫苗组，见图1。
图1肠道病毒71型疫苗免疫后疫苗组和对照组抗肠道
病毒71型中和抗体滴度变化情况
2. 3免疫后5年抗EV 71中和抗体阳性率分别以抗EV 71中和抗体滴度8(x2分别为
816. 84、575. 40、581. 52、336. 82、107. 93)、16(；^2 分 别为 842. 90、642. 78、655. 04、343. 88、133. 14)、32 (X 2 分别为 748. 72、498. 68、562. 56、339. 49、 130. 69)作为阳性判定标准，E
V 71疫苗免疫后56 d 、 8个月、14个月、26个月、64个月，疫苗组抗EV 71 中和抗体阳性率均高于对照组（P 值均<().()1)。由 各检测时间点检测结果可见，疫苗组抗EV 71中和 抗体阳性率维持在一定水平，对照组抗EV 71中和 抗体阳性率随时间的推移明显增高，在第26个月后 增高较为明显。具体结果见表2。2. 4
不同年龄亚组免疫后5年抗EV 71中和抗体 阳性率和GMT
免前阴性人6〜11月龄（z 2分别为76. 00、 174. 05、188. 98、107. 52、39. 65)和 12〜35 月龄亚组 (X 2 分别为 157. 19、4()1. 32、393. 33、194. 19、68. 87) 免疫后56 d 、8个月、14个月、26个月、64个月，疫苗 组抗EV 71中和抗体阳性率均高于对照组且差异有 统计学意义（P 值均<〇. ()1)，在26个月对照组抗 EV 71中和抗体阳性率显著增高，在64个月达到最 高值，见表3。6〜11月龄（《值分别为34. 90、 26.09、29. 85、18. 52、12. 29)和 12〜35 月龄亚组 U 值分别为 46. 30、17. 37、25. 89、14. 90、7. 34)免疫后
表1
肠道病毒71型疫苗受试者人口学基本情况组别接种疫苗时年龄/月
人数（比例/%)
人奴
•T ± S 范围
中位数
女
男
疫苗组23517. 1土7.96〜3516.096(40. 9)139(59. 1)对照组25517.0 ±7. 66〜3515.0118(46. 3)137(53.7)总计
490
17. 0±7.8
6〜35
15.5
214(43.7)
276(56.3)
• 264 •
国际生物制品学杂志 2020 年 12 月第 43 卷第 6 期 Int J BiologicaLs，December 2020，Vol. 43，No. 6
时间/月
56 d 、8个月、14个月、26个月、64个月疫苗组抗
EV 71中和抗体G M T 均高于对照组且差异有统计
学意义（P 值均<〇.()1)。2个亚组中，疫苗组抗 EV 71中和抗体G M T 均在免疫后26个月、64个月 明显增高，对照组均在64个月显著增高，见图2。
3
讨论
EV 71灭活疫苗（V ero 细胞）I —I 期临床试 验显示了较好的安全性和免疫原性，M 期临床试验 中对EV 71感染所致手足口病保护效果达到90% 以上[6]，同时对不同基因亚型EV 71的交叉免疫原 性检测结果也表明，EV 71疫苗免疫后对B 1、B 4、
B 5、
C 4a 等亚型有良好的交叉中和作用[”M 1]。I
D 期 临床延期1年观察结果显示，该疫苗免疫后第二年
依然具有较好的免疫持久性和保护效果，但是有关 该疫苗长期的免疫原性和保护效果缺乏研究数 据[7]。在n 、in 期临床研究中，该疫苗两针免疫后
28 d 中和抗体达到最高值，免疫后半年中和抗体滴 度下降约一半，免疫后1年疫苗组抗E V 71中和抗 体滴度为130.77，中和抗体阳性率在90%以上；该 疫苗免疫后2年抗E V 71中和抗体滴度为551. 18, 中和抗体阳性率在95%以上，E V 71疫苗组中和抗 体水平和阳转率均显著高于安慰剂组[3’6]。EV71 疫苗免疫后2年中和抗体水平相较于1年增高，提 示E V 71自然感染的加强作用。在完成临床方案规 定的2年期随访后未进行后续随访观察，在5年后 仅进行了血清采集，未收集其他数据。对此期间的疫
表2肠道病毒71型疫苗接种后不同时间疫苗组和对照组抗肠道病毒71型中和抗体阳性人数（阳性率/%)
组别56 d 8个月14个月26个月64个月
抗体滴度>8疫苗组235(100. 00)233(99. 15)234(99. 57)228(97. 02)235(100. 00)对照组8(3. 13)51(20. 00)48(18. 82)80(31. 37)176(69. 20)抗体滴度>16疫苗组234(99. 57)226(96. 17)231(98. 30)228(97. 02)234(99. 57)对照组4(1.57)24(9.41)27(10.59)78(30. 59)158(61.96)抗体滴度>32疫苗组225(95. 74)202(85. 96)213(90. 64)227(96. 60)230(97. 87)对照组
4(1.57)
23(9. 02)
22(8. 63)
78(30. 59)
153(59.61)
表3不同年龄亚组免疫后抗肠道病毒71型中和抗体阳性(抗体滴度>8)人数（阳性率/%)
组别
56 d 8个月14个月26个月64个月6〜n 月龄
疫苗组(n = 72)72(100. 00)71(98.61)71(98.61)70(97. 22)72(100. 00)对照组(n = 72)
1(1.39)17(23.61)11(15.28)19(30. 59)48(66.67)12〜35月龄
疫苗组(n= 163)163(100.00)162(99. 39)163(100. 00)158(96. 93)163(100. 00)对照组〇|=181)
7(3.87)
34(18. 78)
34(18.78)
61(33. 70)
129(71.27)
图2不同年龄亚组免疫后抗肠道病毒71型中和抗体几何平均滴度变化A 6〜11月龄B 12〜35
月龄
国际生物制品学杂志 2020 年丨2 月第 43 卷第6 期Int J Biologicals，December 2()2()，Vol. 43，No. 6• 265 •
苗组的疫苗加强、自然感染加强影响无法评估，这也 是本研究的局限性。
本临床研究中，每批次中和抗体检测试验均有 质控血清，所有检测结果均在质控血清成立的情况 下进行判定。对照组免前阴性人受试者随年龄增 长，抗EV71中和抗体阳性率和抗体水平逐年升高，疫苗免疫后5年血清中和抗体阳性率达到69. 02%，中和抗体滴度为55. 58，提示我们EV71隐性感染 的
作用。新加坡进行的EV71血清学调查研究发 现，2岁以上儿童血清阳性率以每年12%速率逐年 增加，在5岁及以上年龄儿童中EV71血清阳性率 维持在约50%[12]。泰国学者对泰国东北部省抗不 同亚型EV71中和抗体在不同年龄儿童中的血清流 行病学研究表明，在1〜11岁人中抗EV71中和 抗体阳性率由13%升高至82%，中和抗体滴度由8 升高至48，其中1〜3岁血清阳性率有明显升高，但 仍低于50%[13]。在进行的一项不同年份 血清EV71中和抗体相关研究也发现，在7〜11月龄婴幼儿中，抗EV71中和抗体阳性率较低（0%〜15%)，此后随后年龄的增长，中和抗体阳性率逐年 增高，在6岁及以上儿童中维持在较稳定水平(50%)[u]。中国大陆地区进行的类似研究也表明 抗EV71中和抗体阳性率随儿童年龄的增长逐年上 升，在6岁以后达到较稳定水平。其中，在安徽省六 安市区进行的不同年龄儿童的血清流行病学研究表 明,2006年和2007年此地区5〜7岁和8〜11岁儿 童抗EV71中和抗体阳性率分别在40. 5 %和60. 9%以上[15]；另一项相关研究结果也基本相似，上海地 区2014—2016年手足口病流行病学研究结果也发 现，6月龄〜1岁婴幼儿抗EV71中和抗体阳性率较 低，随后逐年升高，3〜5岁健康儿童50%以上血清 抗EV71中和抗体阳性，6〜18岁阳性率达到60%以上，提示EV71隐性感染的作用[16]。以上研究均 表明，EV71隐性感染在人中普遍存在，与本研究 结果基本一致。
在对该疫苗免疫后5年的免疫持久性研究中表 明，该EV71疫苗免疫后第5年抗EV71中和抗体 阳性率疫苗组和对照组分别为1()()%和沾.()2%，中和抗体滴度分别为369. 57和55. 58，在EV71自然 感染的作用下，虽然对照组阳性率和中和抗体滴度 有明显的升高，但依然低于疫苗组。在D1期临床试 验中，
探索性研究结果初步表明抗EV71中和抗体 滴度16或32可能作为该疫苗的有效性免疫替代终点指标，因此，我们分别以抗EV71中和抗体滴度 8、16和32为阳性判定标准，分析结果趋势基本一 致，疫苗组阳性率均高于对照组。对不同年龄亚组 受试者进行分析，结果显示，EV71疫苗免疫后5年 6〜11月龄和12〜35月龄亚组的疫苗组中和抗体 阳性率均为1(>〇%，对照组分别为66. 67%和 71. 27%;6〜11月龄和12〜35月龄亚组的疫苗组 抗EV71中和抗体滴度分别为367. 14和37〇.M，对照组分别为63. 66和53. 43。疫苗组抗EV71中和抗体滴度较EV71疫苗免疫后2年略有下降，但 仍维持在较高水平，且抗EV71中和抗体阳性率和 中和抗体滴度疫苗组均显著高于对照组。该结果提 示，该EV71疫苗免疫后EV71的自然感染有明显 的加强作用，该疫苗免疫后5年依然具有较好的免 疫持久性和保护效力。
北京科兴生物制品有限公司的研究结果显示，EV71疫苗免疫后2年内对EV71感染所致疾病保 护率可达94%以上，抗EV71中和抗体滴度为56.3，依然高于对照组（14. 6)[5]；同时，5年的免疫 持久性观察结果显示，该疫苗免疫后5年内抗EV71中和抗体阳性率维持在一定水平，第5年阳 性率可达到94. 34%，作者认为EV71疫苗基础免 疫后暂时没有加强免疫的必要性[n]。中国医学科 学院医学生物学研究所的研究表明，EV71疫苗两 针免疫后4周抗EV71中和抗体滴度达到峰值(170. 6)，在免疫后半年下降至88. 3，但抗体阳性率 依然保持在较高水平(98%)，同时该项研究表明，该 疫苗两针免疫后第4周和6个月，6〜23月龄和 24〜71月龄受试者中和抗体滴度无明显差异，提示 在EV71疫苗受试者中，血清阳性率和中和抗体滴 度在不同年龄组中相对稳定[~。另一项EV71疫 苗临床研究也表明，疫苗免疫
后2年抗EV71中和 抗体阳性率仍在95%以上，且中和抗体滴度和阳性 率均显著高于对照组[19]。有关EV71疫苗这些研究结果均提示，EV71疫苗具有较好的免疫原性和 保护效果，与我们的研究结果较为相似。
本研究结果显示，该EV71疫苗两针基础免疫 后5年抗EV71中和抗体仍保持在较高水平，提示 该疫苗具有良好的免疫持久性。试验为EV71疫苗 接种后的长期免疫持久性提供了研究数据，同时对 我国大规模应用EV71疫苗的免疫策略制定具有指 导意义。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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