技术
四种中草药
文丨深圳市太丰东方海洋生物科技有限公司林炎权王康林先李秀娟
弧菌是海洋环境中最常见的细菌类之一，广泛分布于近岸及河口海水、海洋生物的体表及肠道中，是海水、原生动物、鱼类等海洋生物的正常优势菌。弧菌病已成为世界性的问题，其宿主范围极广，包括养殖和野生鱼类。据权威报道，弧菌病已侵染48种海水鱼类。 本研究筛选了4种中草药分别对4种弧 菌（溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌）进行体外抑菌实验，为使用中草药有效控制水产养殖动物弧菌病奠定基础。结果 表明，在药液pH值调至中性后，五倍子和石榴皮能有效抑杀四种弧菌。 一、材料与方法
1.实验菌株和药物
溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌菌种由广东海洋大学深圳研究院赠送，中草药购自正规途径。四种中草药分别为蓼科中的大黄（根茎）、黄连（根茎）、
漆树科种的五倍子（虫瘻）、石榴科的石榴（果皮）。
2. 培养基
蛋白腺5g，牛肉膏3g，酵母粉lg，氯化钠20g，加超纯水至1L，调pH至7.2-7.4，高温高压灭菌。固体培养基为每lOOmL液体 培养基加入1.5g琼脂粉。
3.菌液制备
中药抑菌分别将4种弧菌接种于液体培养基中. 28七震荡（200r/min）培养6~8h，采用平板计数法计数，用液体培养基稀释菌液至1x106efu/mL，于4七保存备用。
4.中草药药液的制备
4种中草药干燥粉碎后各取20g，用400mL蒸憎水室温浸泡4h后煎煮，沸水煎煮40min左右，冷却，4层纱布过滤药液，药渣再用400mL蒸僧水同前法煎煮1次，冷却，
4层纱布过滤药液，合并两次滤液，加热浓缩至20mL，使其终浓度为lg/m L o于保存备用。
5.药物体外抑菌实验
采用琼脂扩散法测定了4种常见中草药对4种海洋鱼类致病弧菌的抑制作用。根据 抑菌作用测定的结果，选取有抑菌作用的中草药药液，测定原液pH值，并将原液pH值调至7.0左右，测定调pH后药液的抑菌作用。抑菌效果判定：抑菌圈直径M20mm为强抑菌作用，"+++"表示；15mm~20mm为中等抑菌作用，"++"表ZJs;10mm~15mm为弱抑菌作用，“+”表示。
6.最低抑菌浓度（MIC）的测定
根据平板抑菌作用测定的结果，选取有抑菌作用的中草药药液用于试验。采用试管二倍稀释法测定药液对菌液的MIC值和MBC值。药物最高稀释管种无细菌生长者对应的药液浓度即为该种药物对供试弧菌的MIC值。
7.最小杀菌浓度（MBC）的测定
在M1C试验基础上继续培养至48h，观察细菌生长情况，无菌生长的最高稀释管对应的药液浓度即为MBC值，并进一步验证试验，分别吸取该管及上一浓度梯度管的培养液O.lmL，涂布于相应的琼脂培养基上，28七培养24h，观察是否有菌生长，最小杀菌浓度管无菌落形成则表明前面判断正确，否则有误，需重新实验。
&数据处理方法
用SPSS Statistics17.0软件中的成对样本
I 104
技术检验进行数据统计分析.显著性检验水平P<0.05为显著，P
V0.01为极显著。
二、结果
1.四种中草药的抑菌效果
四种中草药体外抑菌实验表明其对于四种海洋鱼类致病弧菌均有抑制作用（表1-4）0其中五倍子和石榴皮的抑菌作用最强；大黄和黄连的抑菌作用次之。
2.MIC和MBC测定结果
采用二倍试管稀释法测定药物对四种弧菌的MIC和MBC O将原始药液pH值调至中性后，五倍子的抑菌效果最好，对溶藻弧菌、副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌的MIC值分别为6.905mg/mL、7.373mg/mL
、8.055mg/mL、6.315mg/mL,MBC值分别为8.313mg/mL、7.953mg/mL、&965mg/mL、7.805mg/mL；石榴皮次之，MIC值分别为16.375mg/mL、17.235mg/mL、15.315mg/mL、17.313mg/mL,MBC值分别为30.235mg/mL、32.215mg/mL、31.965mg/mL,30.375mg/mL；大黄和黄连对四种弧菌的MIC值和MBC值均为500mg/mL。
表1四种中草药对溶藻弧菌的抑菌实验
中草药药液pH抑菌圈直径（mm）抑菌效果五倍子** 4.13122.08±0.41+++
石榴皮** 3.90520.68±0.34+++
大黄* 6.573^16.80±0.66++
黄连** 3.10515.55±0.23++
表2四种中草药对副溶血弧菌的抑菌实验
中草药药液pH抑菌圈直径（mm）抑菌效果五倍子" 4.13123.44±0.53+++
石榴皮" 3.90521.37±0.72+++
大黄* 6.57316.35±0.21++
黄连** 3.10516.02±0.59++
表3四种中草药对鳗弧菌的抑菌实验
中草药药液pH抑菌圈直径（mm）抑菌效果五倍子** 4.13121.96±0.35+++
石榴皮** 3.90520.34±0.584-4-4-
大黄* 6.57317.38±0.66++
黄连** 3.10516.09±0.23++
表4四种中草药对创伤弧菌的抑菌实验
中草药药液pH抑菌圈直径（mm）抑菌效果五倍子** 4.13122.34±0.36+++
石榴皮** 3.90522.08±0.48+++
大黄* 6.57317.38±0.60++
黄连** 3.10515.83土0.59++
三、讨论
本研究中，五倍子、石榴皮、大黄和黄连四种中草药的水提原始药液的pH值分别为4.131、3.905、6.573和 3.105，在抑菌试验种均具有较强的抑菌作用，但将药液pH值调至中性后，其抑菌效果均发生显著降低。推测原因可能是上述药液的酸性同样抑制了弧菌的增长及繁殖。对药液调节pH值前后的抑菌圈直径进行t检验，结果也表明其差异显著。所以，药液的pH值也是影响中草药抑菌效果的重要因素之一，因此进行抑菌试验时，将药液pH值调至中性是必要的。
本研究中的五倍子对四种海洋鱼类致病弧菌均有较强的抑杀作用，这与先前的研究结果一致。五倍子富含隸质，药物成分中化学键振动的波长等于某种细菌的长度时发生共振，化学键的共振有杀菌作用，而糅质中的0-H键波长在许多细菌长度范围之内。本研究中石榴皮对四种弧菌同样有抑杀作用。先前也有研究表明，石榴皮对哈维氏弧菌、河流弧菌和鳗弧菌均有很好的抑制作用。现代药理研究表明：石榴皮种的革柔质、黄酮类化合物是其抗菌的活性组分。
目前，中草药防治鱼病的研究基础和经验尚不能满足生产需求，且国内外关于该方向的研究刚刚起步。中草药的活性成分复杂，并且其种类、含量受自身遗传、分子结构及外界环境条件的影响会有地域性和季节性等变化，同时结构难以鉴定，因此应加强活性成分的分离鉴定以及构效关系的研究，为
中草药防治鱼病奠定基础。囂
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