论著•基础研究MiR-181b-5p在胃癌中的表达及生物信息学分析 李晓晴，冯新，陈雪诺，马战，姜政（重庆医科大学附属第一医院消化内科，重庆400016)
[摘要]目的：研究M iR-181b-5p在胃癌中的表达水平，并进行生物信息学分析，探讨其在肿瘤发生、发展中 的作用。方法：在G E O数据库检索并下栽胃癌的m iR N A数据，提取数据进行独立样本T检验和绘制R O C曲线，进行 M eta分析，预测M iR-181b-5p的靶基因，并进行G O功能和K E G G通路分析。结果：检索筛选后得到5个m iR N A芯片
数据集，M eta分析显示胃癌和正常胃组织的m iR-181b-5p的表达水平有差异，差异有统计学意义（P= 0.008)。预测
得到145个miR-181b-5p的靶基因，G O功能分析表明靶基因主要富集在转录的调控、细胞增殖和细胞周期的调节、蛋
白质结合的调节等方面，差异有统计学意义（P<0. 05); K E G G通路分析显示其主要涉及背腹轴形成、肿瘤m iRNA、雌激
素信号通路、神经营养蛋白信号通路、肿瘤的中心碳代谢等，差异有统计学意义（P<0.05)。结论:m iR-181b-5p的上
调与胃癌的有密切的联系，对胃癌的诊断可能有重要的意义。
[关键词]MiR-181b-5p；胃癌；生物信息学
The expression of MiR-181 b-5p in gastric cancer and bioinformatics analysis LI Xiao-qing，FENG
Xin，CHEN Xue-nuo，et al.(Department of Gastroenterology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400016，China)
mirna靶基因分析
Abstract ：Objective To investigate the expression level of miR-181b-5p in gastric cancer，and to perforin bioinfor^natics analysis and its role in tumorigenesis.Method Methods：The miRNA data of gastric cancer were dow-nloaded from the GEO database，and the data were extracted for independent sample t-test，ROC curve drawdng and meta-analysis.The bioinlomiatics analysis of miR-181b-5p involved target prediction analysis，gene ontolog^^enrichment and KEGG pathw-ay enrichment.Re
sults Five miRNA microarray data were collected，and statistical analysis showed that mir-181b-5p h
ad diagnostic value for
gastric cancer.The meta-analysis showed that there were statistically significant differences in the expression levels of mir-
181b-5p in gastric cancer and normal gastric tissues(P= 0.008). 145 target genes of mir-181b-5p were predicted，and the
GO function analysis showed that the target genes were mainly concentrated in the regulation of transcription，cell proliferation，
the regulation of cell cycle arrest，and regulation of protein binding (P<0. 05). KEGG pathway analysis showed that it was
mainly involved in Dorso-ventral axis for^mation，MicroRNAs in cancer，estrogen signaling pathw-a y，neurotrophic protein signa
ling pathway，Fox O signaling pathway，MAPK signaling pathway，and central carbon metabolism in cancer (P<0. 05)
.
Conclusion M iR-181b-5p expression is significantly higher in gastric cancer，and it has certain diagnostic value for gastric cancer.
Key Words：MiR-181b-5p;Gastric cancer;Bioinfomiatics
胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率一直居 高不下。由于缺乏肿瘤标志物和特异性的症状与体征，早期 诊断以及早期存在一定的困难。尽管近年来胃癌的诊断 和取得了很大进展，但由于肿瘤的复发和转移，胃癌患者 的预后仍然较差。目前，肿瘤血清标志物如癌胚抗原（C E A)、胃蛋白酶原、幽门螺杆菌抗体以及胃镜和组织病理学检查是 用于诊断和评估疾病的主要手段，但这些诊断方法对早癌的 检出率较低[1]。因此，寻求可用于胃癌早期检测和大规模筛 选的生物标志物显得尤为重要。
微小RN A(m iRNA)是具有17 ~25个核苷酸的内源性非编码调节R N A，其在转录后基因调节中起重要作用[2]。由于m iRN A存在于涉及肿瘤的基因组区域中，故越来越被认为是 肿瘤诊断和预后的潜在生物标志物。近年来发现，m iR N A在 肿瘤中发挥致癌或抑癌作用。有研究发现，m iR-181b-5p参 与神经胶质瘤[3]、肝癌[4]、结肠癌[5]、肺癌[6]、胰腺癌[7]等多 种癌症的发生与发展。然而，有关m iR-181b-5p在胃癌中的 表达和作用机制却罕有报道。
GEO(Gene Expression Omnibus)是由美国国立生物技术信 息中心（NCBI)创建并维护的基因表达数
据库，是当今最大、最 全面的公共基因表达数据资源。本文通过G EO数据库的miRNA芯片数据，结合统计学和生物信息学分析方法，研究 m iR- 181b-5p在胃癌中的表达情况，并初步探讨其可能的作用机制。
通讯作者：姜政
1资料与方法
1.1 —■般资料：在G E O 数据库（0他6[又口批81〇〇〇111〇止仙，^;-
tp ://www . ncbi . nlm . nih . gov /geo /)检索并下载胃癌的 miRNA
数据，检索词为“gastric cancer ”，“mici 'oRNA ”。纳人标准:① 胃癌的m iR N A 数据物种为人类;②有肿瘤组和正常对照组； ③样本数量超过2例;④样本数据可以用来计算。排除标准： ①样本为血液或腹水的;②样本是胃癌细胞系的;③样本中无
m iR -181b -5p 相关数据;④样本中有其他干扰因素。
1.2 方法
1.2.1 数据提取和统计学处理：下载m iR -181b -5p
的表达 数据，用SPSS 23. 0分析数据，采用独立样本t 检验，绘制ROC 曲线来检验m iR -181b -5p 的诊断价值。Review，Manager 5. 3 进行M eta 分析，卡方检验和I 2检验用于判断数据的异质性， 若/2<25%，表明异质性较小;25%臆/2<50%，表明异质性中 等;P <0. 05或I 2逸50%，表明异质性高。若异质性小或中等， 使用固定效应模型分析；若异质性大，使用随机效应模型分 析。绘制森林图检验数据有无偏移，P <0. 05表示差异有统计 学意义。
1.2.2
生物信息学分析：采用Mii 'DBE 'miRW alU 'Pict -
ai 』10] 、TargetScan [u ] 、Mirtai 'base [12] 、DIANAmici 'oT [13] 预测 m iR -
181b -5p 的靶基因，预测的结果取交集，纳人至少被三个平台 预测到的靶基因，从而减少软件预测的假阳性率。对全部纳 人的潜在靶基因用D A V ID 在线工具[|4]进行G O 功能和KEGG 通路分析。
2结果
2.1数据收集及统计分析结果：从G E O 数据库中收集到5 个 miRNA 芯片数据集：GSE 28700、GSE 30070、GSE 54397、
GSE 78091、GSE 93415，表达数据均已经过标准化处理，结果见
图1，其中GSE 30070、GSE 54397、GSE 93415数据集中胃癌组织 的miR -181b -5p 表达水平均值高于正常组织，且差异有统计 学意义（P 值分别是 P = 0. 0455、P = 0. 0027、P <0.001)。3 个 数据集的R O C 曲线见图2，从GSE 30070、GSE 93415数据的
R O C 曲线可以看出，miR -181b -5p 对胃癌有一定的诊断价值。
2.2 M eta 分析结果：对5个m iR N A 芯片数据集中miR -181b -5p 的表达数据进行m eta 分析，异质性检验示P <0.05，/2 = 83%，异质性大，应用随机效应模型分析，SMD (标准依均数差） 为 1. 09(95% C /:0. 29 ~ 1. 89，P <0. 0001)，Meta 分析显示胃癌 和正常胃组织的m iR -181b -5p 的表达水平有差异，差异有统 计学意义(P = 0. 008)。图3为绘制的森林图。
2.3 生物信息学分析结果：通过6个m iR N A 靶基因预测平 台结果取交集后，共得到145个miR -181b -5p 潜在的靶基因。 各项结果见表1。G O 功能分析结果表明，靶基因的功能主要 为转录的调控、细胞增殖和细胞周期的调节、蛋白质结合的调 节等方面，差异有统计学意义（P <0. 05)。K E G G 通路分析表 明，靶基因主要涉及的生物学通路为：背腹轴形成、肿瘤miR
N A 、雌激素信号通路、神经营养蛋白信号通路、Fox O 信号通
路、M A PK 信号通路、肿瘤的中心碳代谢、H TLV -I 感染等，差 异有统计学意义（P <0. 05)。
图1 5个GEO 数据集中miR -181b -5p 在胃癌组织和正常组织的表达水平
图2 3个GEO 数据集中miR -181b -5p 的ROC 曲
线
Experimental Std. Mean Difference Std. Mean Difference Studv or SubarouD Mean SD Total Mean SD Total Weiaht IV. Random. 95% Cl IV. Randc m. 95% Cl GSE28700130.98020589.24659362290.539551.44953622223.3%0.55 [-0.06.1.15]~w~
GSE300700.125631950.26843469900.026097490.286753923425.2%0.36 [-0.04, 0.76]W
GSE54397164.5366294102.91195391699.3987093832.649476481622.0%0.83 [0.11,1.56]—■—GSE780910.896150370.3717465130.40406520.0812022639.3% 1.46 [-0.67, 3.60]
GSE934150.55080.51005120-0.655150.338882020.3% 2.73 [1.85, 3.61]
Total (95% Cl)
n r.hi* = w
151
nnnm• I* =
95100.0% 1.09 [0.29,1.89]
-
--------1--------1--------______________
Test for overall effect: Z = 2.66 (P = 0.008)
-4 -2 0 2 4
Favours [experimental] Favours [control]图3 miR-181b-5p在胃癌和正常胃组织中表达水平的森林图
表1GO功能和KEGG通路分析结果各项预测的前10项
Term Count PValue BP- positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter23 1.26E-05 BP- transcription,DNA-templated342.81E-05 BP- NLS-bearing protein import into nucleus53.23E-05 BP- intracellular transport of virus65.64E-05 BP- regulation of transcription,DNA-templated27 1.64E-04 BP- peptidyl-threonine phosphoiylation52.45E-04 BP- negative regulation of cell cycle arrest45.36E-04 BP- cell proliferation118.00E-04 BP- transcription from RNA polymerase II promoter139.53E-04 BP- protein import into nucleus50.001245 CC- nucleus722.03E-07 CC- intracellular258.40E-05 CC- nuclear pore62.38E-04 CC- nucleoplasm385.12E-04 CC- nuclear membrane80.002056 CC- cytoplasm560.005053 CC- membrane290.005267 CC- mitochondrial outer membrane60.006031 CC- cytosol380.010999 CC- nuclear periphery30.011336 MF- nuclear loc
alization sequence binding62.48E-06 MF- transcription factor binding12 1.66E-05 MF- DNA binding304.18E-05 MF- protein binding936.48E-05 MF- protein N-terminus binding60.001051 MF- transcription factor activity,sequence-specific DNA binding180.00158 MF- protein transporter activity50.002573 MF- mRNA3'-LTR binding40.006904 MF- poly(A)RNA binding180.008049 MF- protein kinase binding90.010322 KEGG- Dorso-ventral axis formation58.43E-05 KEGG- MicroRNAs in cancer11 1.81E-04 KEGG- Estrogen signaling pathway7 2.24E-04 KEGG- Neurotrophin signaling pathway7 6.31E-04 KEGG- FoxO signaling pathway70.001126 KEGG- MAPK signaling pathway90.001629 KEGG- Central carbon metabolism in cancer50.002391 KEGG- HTLV-I infection80.006849 KEGG- Progesterone-mediated oocyte maturation50.0072 KEGG- Pathways in cancer100.007284
3讨论
胃癌是由于多个基因发生不同遗传变化而导致的多步骤 的结果。由于缺乏高灵敏度和非侵人性的生物标志物，导致 胃癌的诊治和预后未得到明显改善[15]。尽管许多研究一直 在不断地探讨胃癌发生、发展的机制，但具体的分子机理仍未 完全阐明。为了更深人地了解胃癌的分子机制，从m iR N A层 面分析其调控的生物学过程和功能，对肿瘤的诊治有重要意 义。m iR N A可以通过分泌外泌体颗粒从癌细胞释放到体液 中，如血清、血浆、尿液、羊水和胃液等[16]，这可以保护它们免 受核糖核酸酶（RNa
se)的降解。在一定的生理状态下，来源于 不同细胞的m iR N A在体液中会有不同的表达模式[16-17]。因此，m iR N A可能是诊断胃癌有效的非侵人性生物标志物。
miR-181b-5p在许多癌症中的基因表达、分子调控等方 面都发挥着重要的作用。Shi L等人的研究[3]指出，m iR-181b -5p作为肿瘤抑制因子触发生长抑制，诱导细胞凋亡，抑制胶 质瘤细胞的侵袭，异常下调的m iR-181b-5p可能是导致人神 经胶质瘤的关键因素。W angB.指出上调的miR-181b-5p会 促进肝癌的生长、迁移和侵袭[4]。Nakajima G等人发现m iR- 181b-5p在结肠癌组织中过表达，通过调控细胞信号传导和 细胞周期控制等方面促进肿瘤的发生、发展[5]。Tian F等证 明m iR-181b-5p在肺鳞状细胞癌中负调控RA SSF1和 PIK3R1的表达，而RA SSF1和PIK3R1直接参与非小细胞肺 癌的发生[6]。Tomihara H等人的研究[7]表明，ETS1是m iR- 181b-5p的靶标，与胰腺导管腺癌的预后有关。关于m iR- 181b-5p在胃癌中的表达和机制的研究却少有文献报道，国内的一项研究报道了对12例胃癌患者肿瘤组织和癌旁正常 组织进行微阵列研究，结果表明miR-181b在胃癌组织中异常 过表达[18]。同样的，还有一项国内研究也通过R T-P C R法检 测了 46例胃癌患者、27例胃癌前病变患者及21例健康人外 周血浆中miR-181b的表达水平，结果表明在胃癌和胃癌前病 变患者中m iR-181b表达明显增加[19]。但是在另一项研究 中，miR-181b在胃癌细胞中的表达水平明显低于正常组织细 胞，差异有统计学意义[20]。这些研究表明，目前关于m iR- 181b-5p与胃癌的关系和作用机制尚不明确，仍需进一步的 探索。
本研究通过在G E O数据库中检索含有m iR-181b-5p的数据集，比较m iR-181b-5p在胃癌组织和正常组织中的表达 水平，用统计学分析和M eta分析方法，发现胃癌和正常胃组 织的miR-181b-5p的表达水平有差异，差异有统计学意义（P = 0.008)，表明对m iR-181b-5p胃癌有一定的诊断价值。同时结合多个靶基因预测平台得到145个miR-181b-5p的靶基 因，尽可能减少预测的假阳性。对靶基因进行G O功能分析，得到靶基因主要富集在转录的调控、细胞增殖和细胞周期的 调节、蛋白质结合的调节等方面;K E G G通路分析显示其主要 涉及背腹轴形成、肿瘤m iRNA、雌激素信号通路、神经营养蛋 白信号通路、Fox O信号通路、M A P K信号通路、肿瘤的中心碳 代谢等。本研究结合多个G E O数据集进行分析，结果较为可 靠，这为胃癌的诊治提供了一些新的思路。但仍存在一些不足，如纳人m iR N A数据集的异质性较大、芯片测序及标准化 处理的方法不同、需要进一步的实验来验证结果等。
总之，miR-181b-5p的上调与胃癌有密切的联系，对胃癌 的诊断可能有重要的意义，未来需要更多多中心、大样本的实 验来进一步验证。
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[收稿日期：2019-12-20编校：李晓飞]
胃力康颗粒对胃溃疡大鼠炎性因子表达的影响
倪衍平（福建医科大学附属泉州第一医院药剂科，福建泉州362000)
[摘要]目的：初步探讨胃力康颗粒对胃溃疡大鼠IL-6、IL-8表达水平的影响。方法：实验大鼠随机分成正常 组、模型组、组、对照组。O kabe改良法复制实验性胃溃疡模型，组给予胃力康颗粒灌胃，对照组给予法莫替丁 灌胃，疗程共14 d。E L IS A法检测各组大鼠血清IL-6与IL-8含量的变化。结果：模型组大鼠血清IL-6、IL-8水平与 正常组比较明显升高，差异有统计学意义（P<0.05)；组和对照组较模型组明显降低大鼠血清IL-6、IL-8，差异有 统计学意义（P<0.05)，胃溃疡面积亦明显减小，差异有统计学意义（P<0.05)。结论：胃力康颗粒可以降低溃疡大鼠血 清IL-6与IL-8水平，发挥保护胃黏膜的作用。
[关键词]胃力康颗粒；胃溃疡；IL-6;IL-8
Effect of Welikang on the Expression of inflammatory factors in Rat with Gastric Ulcer NI Yan-ping (Department of Pharmacy,Quanzhou First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou362000, China) Abstract：Objective To investigate the curative mechanism of Welikang and the effect of Welikang on the expression of
IL-6 and IL-8 in gastric mucosa in rat with experimental gastric ulcer.Method The rats"were randomly divided into normal group model group,treatment group and control group.The treatment group was given weilikang granules by gavage,and the con
trol group was given famotidine by gavage.The course of treatment was 14 days,and the expression of IL-6 and IL-8 in the
mucosa was measured by ELISA.Results The content of IL-6 and IL-8 in the model group were significantly higher than those in the normal group(P<0. 05);T h e content of IL-6 and IL-8 in the treatment group and the coutrol group were significantly lower than those in the maodel group(P< 0.05 ),and the area of gastric ulcer was also significantly reduced(P< 0.05 ) .Conclusion Welikang can decrease the content of IL-6 and IL-8 in serum,which may be the one basis of the mechanism to accelerate ulcer healing.
Key Words：Welikang granule；Gastric ulcer；IL-6；IL-8
胃溃疡（Gastric ulcer,GU)是消化内科门急诊常见的一种 慢性复发性疾病，其病理主要累及胃黏膜肌层。炎性反应是 胃溃疡重要的发病机制之一[1]，其中细胞因子如IL-6、IL-8 等对溃疡的产生、发展及修复过程产生普遍影响，对胃黏膜损 伤和发展发挥着重要作用[2]。胃力康颗粒能行气活血、泄热 和胃，具有缓解胃痛，消除胃胀的功效，但其对胃溃疡的具体 影响机制尚不明确。为了探讨胃力康颗粒对胃溃疡的作 用是否与抑制炎性因子的表达有关，笔者观察胃溃疡大鼠炎 性反应损伤因子IL-6、IL-8的表达水平及胃力康颗粒干预对 其表达的影响的实验研究。1资料与方法
1.1实验动物与材料：成年雄性S D大鼠，体重200 ~220 g,
福建医科大学动物实验中心提供。胃力康颗粒由四川宝光药 业股份有限公司生产；法莫替丁片由上海信谊药厂有限公司
生产。IL-6、IL-8 E L IS A试剂盒由上海森雄生物公司生产。1.2实验方法：实验大鼠随机分为正常组、模型组、胃力康颗 粒组、法莫替丁对照组等四组，每组10只。依照Okabe 乙酸诱导改良法制备大鼠胃溃疡模型[3]。造模24 h后对照 组和组分别灌服法莫替丁 30 mg/(k g.d)和胃力康颗 粒8 g/(k g.d),1次/d；正常组和模型组灌服相同体积的蒸
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