Vol. 44 No. 3
2222.3
第46卷第3期2222年3月
贵州医科大学学报
JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY
生物信息学分析 miRO21/26e 、lkcRNA GAS5 和 RECK mRNA 在结直肠癌转移中的作用* 孟涛，刘林，王海江
(新疆医科大学附属肿瘤医院胃肠外科，新疆乌鲁木齐832512)
［摘要］目的基于生物信息学筛选结直肠癌转移相关的mRNA 、mRNA 及IncRNA ，分析其在结直肠癌转移
中的作用。方法 通过生物信息学方法筛选出与结直肠癌转移相关的mRNA 、mRNA 及IncRNA ，采用荧光定量
PCR(qPCR )、蛋白质印迹法(Western bUt)检测筛选出的miRO21/26ePncRNA GAS5和回复引导半胱氨酸丰富
蛋白Kazei 基元(RECK) mRNA 在结直肠癌组织中的表达；构建IncRNA GAS5过表达和沉默细胞株验证miRNA 、 IncRNA 和RECK 相互关系。结果 软件预测结果显示miRO21/26e 可以跟RECK mRNA 结合,UcRNA GAS5可
同时结合miRO21/26e;qPCR 结果显示miRO21/26e 在结直肠癌组织中的表达高于相应的癌旁组织(P <
4. 4013或2 45)，而IncRNA GAS5在结直肠癌中表达水平降低(P <2 401)；成功构建GAS5过表达和沉默细胞
株后，结果显示过表达GAS5时miRO21/26e 含量下降(P < 0. 011，或<0.05) , RECK 蛋白含量降低；而沉默
GAS5会上调miRO21/26a 含量(P <2 45)，促进RECK 蛋白表达。结论 miRO21/26a 与IncRNA GAS5在结肠
癌肿瘤组织均存在异常表达，并可能影响RECK 蛋白表达进而影响结直肠癌肿瘤的转移。
［关键词］计算生物学；转移性结直肠癌；UcRNAGAS5； miRNA251 ； miRNA26e ；回复引导半胱氨酸丰富蛋白
mirna靶基因分析Kazel -丿元
［中图分类号］R735. 3 ［文献标识码］A ［文章编号］20960338(2051 )43-9325 06
DOI ：14.59367/j. cnki. 20960334 2421.43.42
Effects of miR-221/22a , IncRNA GAS5 , and RECK mRNA in metastatic colorectal cancer based on bioinformatics
MENG Tec, LI Liu, WANG Haijiang
(Draiyen£ S Gastrointestinal Surgery , thr
Tumcr Hospital af Xinji an g
Metical University , Urumqt P30011, Xinjiang , China )
［AbsSeci ］ Objective To analyze the role of IncRNA GAS5 and miRO22/26 in colorectal cancea
metastasis baseX on bioinformatics. Methode Real-time quantitative PCR ( qPCR) , Western bolt, and bioinformatics were useV to detect the expression of miRNA and UcRNA m cance/ns and parycykce/ns tissues. SW439 cell Une was useV to construct overexpression and silevco of lncGAS5.
The reUtionsPip among miRNA , IncRNA , and p/gnosis of metastatic colorectal cancea were analyzeX.
Reseltt Software preXiction /salts miRO22/26y conld tarpeted bind to RECK mRNA , IncRNA
GAS5 conld tarpeteV bind to miRO22/26y at the same Wme. qPCR results sCoweV that the expression
of miRO22/26y in colorectal cancea Wssces was highea than that of theia cop^esponkinq parycykce/ns tissues (P <6. 062 or P < 6. 25 ) , while that of IncRNA GAS5 decreaseX in colorectal cancea (P <
6. 062 ) . AUea saccessfulU constr/cteX GAS5 overexpression cell Unes , the results sCoweV that miR- 222/ 22c expression was dowk-reaulateX (P <6. 212 or P <6. 25) and the level of RECK protein was decreaseX ; AUea the silevco of GAS5 , miR-022/ 22c expression was up-reaulateX (P <6. 25) ,nd the
level of RECK protein was increaseV. Conclusion miRO22/26y and IncRNA GAS5 have odvions
［基金项目］新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目(2617D01Z385)
322
3期孟涛等生物信息学分析miR-221/26a、mcRNA GAS5和RECK mRNA在结直肠癌转移中的作用
aOnonnal expression in celon cancer tumor tissue.They can affect the expression of RECK protein and the/Oet the metastasis of colorectal cancer tumor,which is closely related to the deXopmeal of colorectal cancer.DeWctUn of its content changes can predict the metastasis of cancer cells in advance.
[Key woalt]computational Uiolopy;metastatic colorectal cancer；lncRNA GAS5;midNA-221；
midNA26a；reversion inducing cysteine Uch protein with gazal motifs(RECK)
结直肠癌(comuctal cancer-是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的前列7J o约有47%结直肠癌患者最终死于复发和转移7-2]，且其发生机制仍不明确。因
此，研究结直肠癌转移的发生机制具有重要的意义。回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元(re-version inducing cysteine Veh protein with gazal mo
tifs；RECK)是一个公认的肿瘤转移抑制因子，研究显示RECK与结直肠癌转移有密切的关系。MR
cuRNA(midNA)是一类长度在15~27个核苷酸
的内源性非编码小分子单链RNA，能通过与靶基因midNA特异性的碱基互补配对，引起靶基因midNA的降解或者抑制其翻译，负调控靶基因的表达，参与和影响细胞分化、组织发育、肿瘤诊断及预后7]；而长编码RNA(mng non-cobing RNA,/-cRNA)是一类长度超过222个核苷酸、不编码蛋白的RNA，在发育、分化及代谢等多方面发挥着重要作用⑷。midNA和1/cRNA都高度保守稳定，可竞争性结合并调控靶基因参与肿瘤的发生发展，因而可作为潜在标志物用于肿瘤的预测、诊断及预后的判断7「4。本研究通过生物信息学方法出结直肠癌转移相关的midNA及1/cRNA，并选取结直肠癌变组织及其对应的癌旁观察其表达，分析它们的相互作用及对结直肠癌转移的影响。
1材料与方法
1.1试剂及仪器
TUzot购自上海生工公司，midcule midNA cDNA试剂盒(KR221).midcule增强型midNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Guen,FP711)及lnR-cule lncRNA荧光定量检测试剂盒(SYBR Greex) (FP472)购自北京天根生化科技有限公司，1/1-GAS5过表达质粒及含1/CGAS5启动子的CRISPR-CasP质粒购自吉凯基因公司，转染试剂Lino-fectamine3602购自Thenno Fisher,DMEM等细胞培养试剂购自Gibce公司；AntUSRTCK抗体(a O23852)和山羊抗兔IgG H&L(HRP,aO22575)购自AU-cam，所用引物U6、RECK及miRNA22/购自广州复能公司。
1.2方法
1.2.1生物信息学预测利用midanda数据库(/microua/home.do、和Stardase数据库(http：//stardase.sysu.edn.cu/(预测RECK mRNA-midNA,midNABncRNA的结合位点并做分析。
1.2.2构建过表达和沉默lncGAS5的SW456细胞在转染的前一天，传代准备SW486细胞，待细胞密度生长至66%~86%时即可用于质粒转染。将2种质粒分别与转染试剂Lipofectamine3002(先用不含血清及双抗的DMEM培养基稀释)混匀，加入到SW450细胞中；于37°C培养箱培养6~5h 后，取出转染细胞，
用2mL新鲜的不含双抗的完全培养基换掉原培养基，转染48h后、加入嘌吟霉素(3.0mg/L)进行筛选。15~5d后收取细胞提取RNA和蛋白。
1.2.2RNA、miRNA‘lncRNA提取取手术切除的结直肠癌患者结直肠癌变组织及癌旁5cm以上的正常黏膜组织，用TUzot提取总RNA，用试剂盒提取miRNA和lncRNA，紫外分光光度仪测定浓度及纯度(OD240//OD285>1-5可用、。按照试剂盒说明书对miRNA和1/cRNA进行荧光定量检测。
1.2.2荧光定量PCR(qPCR)吸取1.2.3中得到的RNA，加入超纯水,27C孵育5min，冷却后置于冰上，加入反转录酶,42C孵育66min,72C加热15min，保存于-22C。基因引物由上海生工生物有限公司合成:JcRNA GAS5,F为5-PTTCT-GGGCTCAAGTGATCCTP3R为5PTTGTGCCATGAG ACTCCATCAGP3；GAPDH，F为5PACCAGCCCCAG CAAGAGCACAAGP3R为5PTTTGCTTGAAGTTTCA CTGGCATCP3；mnRP221F为5PAGCTAAAAAAGC TACATTGTCTGCTGGGTTTCGP3R为5PGATCCGA AACCC AGCAGACAATGTAGCTTTTTTB)o反应条
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贵州医科大学学报46卷件为45C2mid,45C32s、60C32s,72C
5mid,32个循环。实验重复3次，采用2—AA C1法计算基因的相对表达量。
1.2.2ECK蛋白表达水平采用蛋白质印迹法(Westeu blot)，将少量组织或构建过表达和沉默PcGAS5的SW456细胞置于匀浆器中，加入蛋白质裂解液研磨至无肉眼可见组织置于冰上裂解36in，将裂解液转移至离心管中2C15002UmP离心5mo，取上清，在紫外分光光度仪上测定蛋白质浓度并置-22度保存。制胶后，加入50/变性蛋白溶液进行电泳及蛋白转移，结束后加入RECK一抗和二抗进行孵育，最后进行凝胶图像分析。
1.3统计学方法
各项实验均重复3次，所得结果用SPSS19.2软件进行统计学分析，计量资料用均数土标准差3±s)表示,2个独立样本资料比较采用i检验, P<0.05认为差异具有统计学意义。2结果
2.1预测RECK/miRNA/lncRNA结合位点及组织标本中含量测定
利用miRanda数据库预测结果显示(表1、，RECK mRNA与mnRP221有4个结合位点，与mnR 26a有1个结合位点，推测miR-221/26a能靶向结合到RECK mRNA上对其进行调控。利用Starbase 数据库预测结果显示1/cRNA GAS5与miR-221/ 26a存在1个结合位点，提示它们之间存在相互作用关系。因此，利用qPCR对结直肠癌组织和癌旁组织中1/cRNA及miR-221/26a的含量进行验证(图5，结果显示在结直肠癌组织中，miR-221/26a 的表达高于其相应的癌旁组织(P<0.021、或2.05),1/cRNA GAS5在结直肠癌中表达水平降低，差异具有统计学意义(P<2.021)。
表1miRanda数据库预测RECK mRNA与miR-221/26a结合位点TOC Predicted binding sites of RECK mRNA with miR-221/26a using miRanda dataOase 种类结合位点可能性评分
yso-mid-211 RECK
hse-mid-h11 RECK
hse-mid-h11 RECK
hse-mid-211 RECK
hse-miR-26g-l RECK 3ipcCGCUUCCUAUUGUUUCCCUaB'
2714^caGUGACUUUUGUGAAAGGGAg-C r
3,-cauuaGGUCGUCUGUUACAUCGa
12244JeovaUCAGU-GCUGAUGUAGCaB'
3'BuuuygGUCGUCUGUUACAUCGaB'
447:2,-huuuaaCAUCCUUUGGUGUAGCa-C,
3icuuUGGGUCGUCUG-BUACAUCgaB'
772:2,-hacAUCCA-BGUUAAAUGUAGag-C,
3'-ecaceuacauuaguuCUUAUCc-e'
44704'-haupaufaagaagguGAAUAGc-C'
mirdVR score：-0-352
PhastCo/s score：0.6497
mirdVR score：-0.3021
PhastCo/s score：0.7231
mirdVR score：一0.054
PhastCo/s score：0.5214
mirdVR score：-0-537
PhastCo/s score：0.6432
mirdVR score:-0,0099
PhastCo/s score：0.7473
Tab02
表2Starbase数据库预测1/cRNA GAS5与miRB21/26a结合位点
Predicted binding sites of lncRNA GAS5with miR-221/26a using Starbase dataUase
midNA种类基因ID基因名称 基因类型靶点
hse-mid-h51Bp hse-miR-26g-5p ENSG00004734741GAS2pucx p P tu/pUpt
ENSG00004734741GAS2pucx p P tu/pUpt
15:53833269-538332927-]
chrl：53833308-5383329[-]
注：与癌旁组织比较，⑴、P<0.001,«、P<0.02o
2.2过表达1/cRNA GAS5的SW480细胞中In-miP221相对含量为2.007±2.601，空载组为
cRNA GAS5及miR-221/26a表达
取稳转1/cRNA GAS5后的SW456细胞提取RNA和蛋白，结果如图2所示。结果显示，过表达组SW456细胞中GAS5相对含量为2.839±2.045，转染空载组含量为2.231土2-253过表达组GAS5的含量是空载组的4.6倍,2组比较差异有统计学意义(P<2.05)o过表达组SW456细胞中的2-015±2-002，过表达组低于空载组，仅为空载组的2.4倍，差异有统计学意义(P<0.21)。过表达组SW456细胞中的miP22a相对含量为2.0055±2-0023，空载组为2-015±2.021，过表达组低于空载组，仅为空载组的2.48倍，差异有统计学意义(P<0.21)。Westeu blot结果显示，过表达组细胞中的RECK蛋白表达含量低于空载组。
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3期孟涛等生物信息学分析miRO21/26e P kcRNA GAS5和RECK mRNA在结直肠癌转移中的作用
miR221miR26a 结直肠癌组织癌旁组织
图1IncRNA GAS5及miRO21/26e在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达
Fig.1The relative expression levels of IncRNA,miR-921,end miRO5e in
CRC tissues and correspopdinq adjacent tissues
图2稳转UcRNA GAS5后 SW480细胞中IncRNA GAS5及miRO21/26e表达Fig.2The expression levels of IncRNA,miR-221,and miRO6e in SW480
cells overexpressing IncRNA GAS5
2.2lncGAS5沉默细胞株情况
将质粒转染到SW430细胞后，用qPCR检测lncGAS5、miR221及miR26e含量，结果如图3所示。结果显示,GAS5在沉默组SW480细胞中相对含量约为22005±4.00013，而在空载组则为2236±20456，沉默组低于空载组，差异有统计学意义(P<0.01)，提示成功建立lncGAS5沉默细胞株。miR221在沉默组相对表达含量为2275±6.021，空载组中为6.63±6.02，沉默组高于空载组，差异有统计学意义(P<6.61)o miR25e在沉默组相对表达含量为6.259±22073，空载组中为6.039±0.211，沉默组高于空载组，差异有统计学意义(P<0.01)o提示GAS5的降低在一定程度上会上调miR221和miR25e的含量°Western blot 结果显示，沉默GAS5时,RECK蛋白表达增加。3讨论
我国结直肠癌的发病率和死亡率均呈上升趋势，其发病率、死亡率在所有恶性肿瘤中均居第5位⑹。因
此，寻和发现结直肠癌相关的癌基因并揭示和预测其在结直肠癌的病程进展和转移过程中的功能，对于结直肠癌的诊治具有十分重要的理论意义和实际应用价值。
RECK是一个公认的肿瘤转移抑制因子，其蛋白主要定位于细胞外。它富含半胱氨酸，是一类膜锚定糖蛋白，在常见细胞中通过转录后能调控多种基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，阻遏肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的侵袭与转移⑺。有研究发现，在结直肠癌病人的肿瘤样本中,RECK的表达水平
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贵州医科大学学报49卷
图3沉默IncRNA GAS5的SW480细胞的qPCR及Western blot结果
Fiq.3Thc results of qPCR and Western blot in SW480celts silenciny IncRNA GAS5
和病人复发风险有关，高浓度的RECK往往预示着病人的复发风险较低。此外通过动物及细胞实验发现，提升RECK的表达能抑制肿瘤细胞的侵袭、转移及血管新生“4。以上研究提示RECK与结直肠癌转移有密切的关系。课题组在前期研究中探讨了RECK蛋白和mRNA在原发肿瘤组、结直肠转移灶组以及癌旁组织的表达情况，证实了RECK蛋白及mRNA水平在肿瘤组中是呈低表达的，且在转移灶组中RECK蛋白及mRNA表达量更低。
mikNA是一类约含22个核苷酸的非编码小分子单链RNA，通过与靶基因mRNA的3'端非翻译区上的相应靶点结合，能抑制或降解特定靶基因，从而起到调节蛋白质合成的作用［4「5］。有研究发现miXO5-8p通过调节内皮细胞相关因子表达，可以促进血管通透性和血管生成，同时大肠癌细胞的miXO5-8p外显子可显著诱导大肠癌的血管渗漏，促进大肠癌在肝、肺的转移。此外,miR-25Op的表达水平在发生转移的大肠癌患者中明显高于无转移者，证明了miRO5Op是一种促进结直肠癌转移的miR
NA U0］o有学者发现与直肠癌相关的miRNA约有54多个，这些miRNA可通过改变Wnt通路的—连环蛋白（-catenin）、表皮生长因子受体（EGFR）、转化生长因子-B（TGF-B）和肿瘤抑制蛋白（TP53）等信号通路来影响大肠癌的生存、增殖、侵袭和转移，因此,miRNA与结直肠癌的发生发展密不可分"⑸，而IncRNA与miRNA一样，属于非编码RNA，区别是IncRNA转录本长度超过200个核苷酸，在生物发育、分化和代谢等方326面起到了重要调控作用，成为近年来的研究热点［6「5］。不少研究显示IncRNA和miRNA存在竞争结合参与肿瘤细胞的侵袭和转移［6「01］。如Wany等a人在综述中就提到44多种IncRNA/ miRNA参与结直肠癌发生发展的情况。
本研究利用生物信息学进行预测，发现了多条与RECK mRNA相结合的miRNA，其中miRO21与之有4个结合位点，miRO6v与之有1个结合位点，由此推测RECK表达与这2个miRNA有关系，进而对结直肠癌病人的肿瘤组织和癌旁组织中miR021/26o进行验证。结果显示这2个miRNA 在结直肠癌肿瘤组织中高表达。这或许暗示了在结直肠癌中，上调的miR021/miR06o通过结合RECK mRNA，抑制了RECK蛋白的表达，从而促进结直肠癌的转移。同时数据库分析结果还显示IncRNA GAS5能同时结合miR021、miR06o，本研究也对结直肠癌病人的肿瘤组织和癌旁组织中IncRNA GAS5进行验证，结果显示IncRNA GAS5在结直肠癌肿瘤组织中呈低表达。
以上结果初步提示在结直肠癌细胞中，IncRNA GAS5表达降低，会使得miRO21和miRO6v 的丰度升高，从而抑制了RECK mRNA表达，最终促进结直肠癌细胞转移。基于以上推测，本研究在SW480细
胞中过表达了IncRNA GAS5，通过测定GAS5含量提示我们过表达细胞模型构建成功且miR021/26o含量随着GAS5的增加而下降,RECK 蛋白含量降低，提示GAS5能通过负反馈miR-521/ 26c含量影响RECK蛋白表达。同时，本研究还通过转染含GAS5启动子的CRISPR-BasU质粒，
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