miRNA技术详述
日期：2012-04-26 来源：未知 作者：网友 点击：730次
摘要： miRNAs是一类重要的内源性小的非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。 产品，上生物帮>> >> | |
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解读miRNA （MicroRNA）
引述
精准的基因表达
调控对生物体的生长发育和功能至关重要。过去对基因表达
调控的研究主要集中在转录
因子介导的基因转录
调控方面(激活或抑制基因转录)。而RNA一度被认为是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明RNA在生命的进程中扮演的角远比早前的设想重要，晚近发现一系列小分子
非编码RNA(small noncoding RNA)，包括miRNA
(microRNA)，siRNA
(small interfering RNA)，piRNA (piwi-interacting RNA)和esiRNA
(endogenous siRNA)等，这些小RNA组成了RNA调控网络，在转录水平、转录后及表观遗传等水平控制基因的表达，参与调控包括细胞增殖、分化和凋亡等进程，影响着生物体的生长发育和多种病理过程。小RNA的发现也揭示了真核生物全新的基因表达调控方式。 miRNAs是一类重要的内源性小的非编码RNA分子，大约由21-25个核苷酸组成。miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，通过抑制翻译或降解靶标mRNAs而调节基因的表达。人类基因组中大约存在超过1000条miRNA，其在多种人体细胞类型中大量表达，估计其调节超过60%的哺乳动物基因。miRNA在植物界和后生动物界间表现不同的特性。在植物中，miRNA与其靶基因通过近乎完美互补的方式相结合;而在后生动物中，经常是一条miRNA可以和靶基因的多个位点相结合，或是一条miRNA调节多种靶基因。另外,在后生生物中，mi
RNA靶位点位于mRNA的3’ UTR，而在植物中，miRNA靶位点可以位于3’ UTR，更多情况下是位于mRNA的编码区内。第一个miRNA在上世纪九十年代被发现，直到本世纪初才认识到这是一类在功能上保守的生物调节因子。在此时起，miRNA研究揭示其存在不同基因表达负调控形式，包括转录本降解和扣留(sequestering)，翻译抑制等，并可能参与了对基因表达的正调控(转录和翻译活化作用)。总之，在不同形式的细胞和组织类型中发现了不同的miRNA表达形式，miRNA可能参与了多数生理过程;并且在多种病理状态下，miRNA呈现异常表达，这些异常表达miRNA在疾病发生、发展和转归中发挥了重要作用，当前，基于miRNA的方式研究当前正在进行中。
miRNA的发现历史mirna靶基因分析
miRNA是由Victor Ambros, Rosalind Lee和Rhonda Feinbaum等人在研究lin-14基因在调节线虫发育中作用时发现的。他们发现LIN-14蛋白丰度受到一个由lin-4编码的短RNA产物的调节，来自lin-4基因的61个核苷酸前体生成一个22个核苷酸的RNA，该RNA含有与lin-14 mRNA 3’ UTR部分互补的序列。这种互补特性为抑制lin-14翻译生成LIN-14蛋白的充分必要元件。然而在当时，lin-4却被认为是线虫中特有的现象而被忽视。直到2000年，第二个小
RNA let-7被发现，let-7可以抑制lin-41, lin-14, lin-28, lin-42和daf-12等在发育转型中发挥重要作用基因的翻译。很快又发现let-7在多个物种间保守存在，表明在更广泛的生物物种中存在这种调节。
miRNA的命名术语
当前，发展了一套标准的miRNA命名系统，前缀mir后紧跟“-”和相应数字，数字通常显示名字的先后次序。而小写的mir-指pre-miRNA，如果使用大写的miR-则指成熟的miRNA。对于差别只有一到两个核苷酸的近似相同的miRNA，在命名时通常另外添加一个小写字母，例如miR-200a和miR-200b。为了区分物种来源，通常在miRNA的前面加上三个字母组成的前缀，如人源性的使用has，而绵羊(Ovis aries)来源的使用oar，其他如v表示来自病毒基因组，D表示果蝇源性的等。如果定位于不同基因组位置的前体miRNA可以生成完全一致的成熟miRNA，则通常使用外加的“-”加数字后缀来区别这种情况，例如hsa-mir-194-1和hsa-mir-194-2位于基因组的不同位置，而剪切生成相同的成熟miRNA序列hsa-miR-194。当两个成熟的miRNA来自于相同的前体miRNA的相反的两个臂，则使用“-3p”和“-5p”后缀(过去曾使用s和as表示，分别来自sense和antisense)。当相对表达水平已知时，通常使用
星号表示该miRNA在表达水平上较其对应的反向臂miRNA低。例如miR-31和miR-31*分别来自于同一前体miRNA的两对应臂，且miR-31为主要存在形式。
miRNA的生物起源
约40%的miRNA基因位于蛋白的内含子中或是不编码蛋白的基因序列中，甚至位于外显子中。虽有例外，它们通常呈正向分布。因此，它们多数与其宿主基因一起受到调节。另有42-48% miRNA基因呈多顺反子形式排布，虽然这并不表示这成簇分布的miRNA在结构和功能上存在相似性，但它们共用一个启动子区域，由2-7个不同的环结构经剪切加工而来。其启动子在模序结构上与由RNA聚合酶II转录的其它启动子，如编码功能蛋白基因的启动子相似。DNA模版并不是成熟miRNA的最终形式，部分人类miRNA存在RNA剪辑，位点特异的RNA序列修饰导致其产物和DNA模版不一致，从而增加了miRNA的多样性，超出了基因组模版的数量范围。
miRNA的转录
miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)转录生成。Pol II结合在以后形成发夹结构的颈环DNA序
列附近。生成的转录本经修饰添加5’帽子结构和3’末端多腺苷酸尾巴结构，并剪切，生成的产物称为初级miRNA (pri-miRNA)，该产物可能长达数千或数百核苷酸，可能包含多个miRNA环结构。RNA聚合酶III (Pol III)转录生成部分miRNA，尤其是上游为Alu序列，tRNAs和哺乳动物广泛散步重复(mammalian wide interspersed repeat (MWIR))启动子单元的miRNA。
miRNA的核内处理过程
单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体。这些发夹结构每个由约70 nt左右的核苷酸组成。每个发卡结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹RNA结构被叫做DGCR8的核蛋白(DiGeorge Syndrome Critical Region 8，该蛋白与DiGeorge综合症关系密切，在非脊椎动物中称为"Pasha")辨认，DGCR8同Drosha酶一起形成微处理(microprocessor)复合体。在该复合体中，DGCR8组织Drosha蛋白的RNase III结构域使其在距离发卡结构约11个核苷酸处切割pri-miRNA，使其释放发卡结构。释放的发卡结构即为前miRNA(pre-miRNA), pre-miRNA在3’存在两个悬空的核苷酸，pre-miRNA 5’为磷酸集团，3’为羟基集团。在果蝇和线虫中存在由内含子直接剪切产生的pre-miRNA，并不经过
微处理复合体过程，这种miRNA称为mirtrons。部分pre-miRNA可发生核RNA剪辑。多数情况下，作用于RNA的腺苷酸脱胺酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADAR)催化腺苷酸生成次黄嘌呤核苷(inosine)，RNA剪辑能够阻碍核内处理过程(例如导致pri-miR-142被核糖体酶Tudor-SN降解)，并改变下游处理过程，包括在胞浆的miRNA处理和靶向特异性(如在中枢神经系统中改变miR-376种子区序列)。
miRNA的细胞核输出
Pre-miRNA发卡通过Exportin-5蛋白的核胞浆穿梭完成从核输出到胞浆过程。Exportin-5蛋白为karyopherin家族蛋白成员，该蛋白通过辨认Drosha RNase III酶切割留下来的3’两个悬空的核苷酸，介导pre-miRNA的输出，该过程由GTP提供能量完成。
miRNA的胞浆处理过程
在胞浆中，pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理。这种内源性核糖核酸酶(endoribonuclease)与发夹结构的3’相互作用并在环的3’和5’臂上完成切割，产生长约22 nt并不完美匹配的miRNA:miRNA*双链结构。不但发夹结构和颈环的大小影响了Dicer酶切割
效率，miRNA:miRNA*双链结构的不完全匹配特性也影响了Dicer酶的切割效率。虽然双链结构中的任何一条都可能成为功能miRNA，但是通常只一链可能进入RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)，在RISC中与其相应靶基因mRNA发生相互作用。
miRNA在植物中的生成情况(Biogenesis)
miRNA在植物中的生成过程与在后生动物中不同，区别主要在核处理和输出过程上。与后生动物在核和胞浆中由两种不同的酶切割不同，在植物中，由Dicer酶的同源基因Dicer样酶1(Dicer-like1, DL1)完成切割处理过程。DL1只在植物细胞核中表达，表明两种反应都发生在核内。植物miRNA:miRNA*双链结构转运出核前，其3’突出序列经RNA甲基化转移蛋白Hua-Enhancer1 (HEN1)甲基化修饰。而后此双链结构被Hasty (HST)由核输出至胞浆，在胞浆中解离生成成熟的miRNA，进入RISC。Hasty蛋白即为后生动物中Exportin 5蛋白的同源蛋白。
RNA诱导的沉默复合体
RNA诱导的沉默复合体(RISC)除了包括成熟的miRNA外，还包含Dicer蛋白和多种其它相关蛋白。RISC也被称为microRNA核酸蛋白复合体(microRNA ribonucleoprotein complex, miRNP)，掺入RISC的miRNA也被称为miRISC。现在认为Dicer对pre-miRNA的处理与双链螺旋的解旋是偶联在一起的。通常情况下只有一条链进入miRISC，对双链中某一条链的偏好选择基于相对另一条链的热动力学不稳定性和更差的碱基配对能力。颈环的位置可能也影响了掺入链的选择性。不进入RISC的链被称为passenger链，其miRNA被冠以星号(*)，具有更低的稳定性，通常情况下被降解掉。在某些情况下，两条链都具有活性，成为针对不同靶基因mRNA的功能miRNA。Argonaute (Ago)蛋白成员在RISC功能中处于中心地位，该类蛋白为miRNA诱导的基因沉默的必需组分，其含有两个保守的RNA结合结构域。PAZ结构域结合成熟miRNA的3’序列，PIWI结构域组装核酶H (ribonuclease-H)，并与导引链(miRNA)5’端结合。Ago蛋白与成熟miRNA结合使其正确朝向，以便对靶基因mRNA完成切割。一些Ago蛋白，例如人Ago2，直接切割靶转录本;另外，Ago蛋白也可能招募其它蛋白行使翻译抑制功能。在人类基因组中含有8个Argonaute蛋白，根据序列相似性分为两个家族：AGO和PIWI。AGO蛋白有4个成员，存在于所有哺乳动物细胞中，在人类这类蛋白称为E1F2C/hAgo;PIWI存在于精细胞和造血干细胞中。RISC的其它组成成分还包括T
RBP [human immunodeficiency virus (HIV) transactivating response RNA (TAR) binding protein]，PACT (protein activator of the interferon induced protein kinase (PACT),SMN复合体，脆性X智障蛋白(fragile X mental retardation protein，FMRP)和Tudor-SN (Tudor staphylococcal nuclease-domain-containing protein)等。
miRNA介导的基因沉默模式
miRNA与靶mRNA的典型作用方式主要有两种。在大多数情况下，复合物中的单链miRNA与靶mRNA的3’ UTR不完全互补配对，阻断靶基因的翻译，从而调节基因表达。这种方式主要影响蛋白表达水平，并不影响mRNA的稳定性。近来，有研究对翻译抑制理论提出质疑，发现被抑制的靶mRNAs和miRNAs共同聚集于胞浆中被称为P小体(processing bodies，P-bodies)的区域，这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。P小体可能是作为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器，减少一些特定P小体组成蛋白的表达能够缓和miRNA介导的基因表达抑制作用。P小体是胞浆中的一定区域，它包含参与多种转录后过程的蛋白质，例如：mRNA降解(mRNA degradation)、无义介导mRNA衰退(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)，转录抑制及RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。
另一种作用方式与siRNA类似，当miRNA与mRNA完全互补配对时，Ago2蛋白通过切割mRNA直接导致其降解，实现基因沉默。以siRNA参与的RNAi为例：siRNA可与RISC结合，作为模板识别mRNA靶子，通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22 nt左右的siRNA，siRNA继续同RISC形成复合体，与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也称为转录后基因沉默(PTGS)。
总之，当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程度有关。miRNA与目的基因配对不完全时，miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用;miRNA与目的基因某段序列配对完全时，就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。另外，miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化，从而影响靶基因的表达。除此外，近来发现快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表达的新机制。在哺乳动物细胞中发现miR-125b和let-7能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴(polyA tail)的去除。用3’组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴，不但可以消除miR-125b对mRNA含量的影响，还可以降低对蛋白质合成的作用，可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺苷酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。
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