1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道⼦的构建） 注：酵母报道⼦（pBait-AbAi）包含⽬的顺式作⽤元件的⼀个或多个拷贝，且插⼊到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。⼤量研究表明最有效的构建应包含⽬的DNA三个以上的⾸尾连接的拷贝。⾸尾连接的拷贝产⽣⽅式很多，但对于长度⼩于20 bp的调控元件，⼈⼯合成寡核苷酸是最⽅便可靠的途径。
（1）设计并合成包含⽬的序列的两条反向平⾏的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物⼀致的粘性末端（建议合成⼀个⽬的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）⽤TE buffer溶解寡核苷酸⾄终浓度100 µmol/L。
（3）将正向链和反向链按照1:1的⽐例混合（退⽕后的双链寡核苷酸最⼤浓度为50 µmol/L）。
（4）95 ?C保温30 s，去除⼆级结构。
（5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。
注：缓慢退⽕，有助于双链寡核苷酸的形成。
（6）冰上放置。退⽕后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备⽤。
（7）酶切1 µL pAbAi载体，⽤凝胶回收纯化或柱纯化的⽅式纯化酶切产物。
（8）将退⽕后的寡核苷酸稀释100倍⾄终浓度为0.5 µmol/L。
（9）在连接反应管中加⼊如下成分：
pAbAi载体（50 ng/µL） 1.0 µL
annealed oligonucleotide （0.5 µmol/L） 1.0 µL
10×T4 DNA ligase buffer 1.5 µL
BSA（10 mg/mL）0.5 µL
Nuclease-free H2O 10.5 µL
T4 DNA ligase （400 U/µL）0.5 µL
race实验
总体积15 µL
注：如果有必要，可⽤1 µL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。
（10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采⽤常规⽅法检测阳性克隆。
注：可⽤酶切或测序进⾏检测。
2 质粒转化酵母细胞，⽣成Bait-Reporter酵母菌株（图）
图3 Bait-Reporter酵母菌株⽣成原理⽰意图
（1）⽤BstB I或者Bbs I酶切2 µL pBait-AbAi，pMutant-AbAi，p53-AbAi质粒，使其在URA3基因处断开，纯化酶切产物。
（2）按Matchmaker Yeast Transformation System 2的步骤⽤1 µl酶切后的质粒转化Y1HGold酵母。
（3）稀释每个转化体系⾄1/10、1/100、1/1000，分别取每个稀释物均匀涂于SD/-Ura琼脂平板上。3 d后挑取5个单克隆，⽤Matchmaker Insert Check PCR Mix1进⾏PCR检测阳性克隆，⽤Y1HGold的单克隆做阴性对照。（4）在PCR管中加25 µl PCR-grade H2O。
（5）⽤⼲净的头轻轻接触酵母单克隆，以获得⾮常少量的酵母细胞。将头伸进PCR-grade H2O中搅拌，使酵母细胞散开。
注：切忌挑取整个酵母单克隆，因为细胞过多会阻⽌PCR反应的进⾏。
如果加⼊细胞后⽔变浑浊，证明加⼊了过多的酵母细胞。
（6）向每个管中加⼊25 µl Matchmaker Insert Check PCR Mix，混匀，离⼼。每个PCR管中现已含有如下反应物：
Matchmaker Insert Check PCR Mix 25 µl
H2O/yeast 25 µl
总体积50 µl
（7）按下述程序进⾏PCR反应；
95 ?C 1 min
98 ?C 10 s
55 ?C 30 s 30 cycles
68 ?C 2 min
（8）取5 µl PCR产物，⽤1%的琼脂糖凝胶电泳分析。
注：引物与AbA基因以及URA3下游的Y1HGold基因组结合，扩增⽚段长约1.4 kb。
图4 PCR检测pBait-AbAi的插⼊情况
正确的PCR检测结果应是：
阳性对照：1.4 kb
阴性对照：⽆条带
（9）分别挑取PCR检测呈阳性的诱饵克隆和p53-AbAi对照克隆，在SD/-Ura 平板上划线培养。30 ?C孵育3 d后，将平板置于4 ?C保存，即为新构建的Y1HGold[Bait/AbAi]菌株和[p53/AbAi]对照菌株。
（10）经过长期放置后，挑取单克隆在YPDA液体培养基中过夜培养，离⼼收
集菌体，⽤ 1 mL预冷培养基（100 ml灭菌的YPDA与50 ml灭菌的75%⽢油混合）重悬菌体，速冻后与-70 ?C保存。
3 检测诱饵菌株AbA r基因的表达
在不存在捕获物的情况下，由于克隆到pAbAi载体中的诱饵序列不同，诱饵菌株报告基因的本底表达⽔平也不相同。例如：
p53-AbAi对照的最低aureobasidin A抑制浓度为100 ng/ml。
注：酵母单杂交实验成功的前提是没有内源转录因⼦能够与⽬的序列结合或者结合能⼒⾮常弱。因此在进⾏⽂库筛选之前，检测所构建的诱饵菌株AbA r基因的表达情况⼗分重要。所以需要进⾏实验以确定进⾏⽂库筛选时抑制诱饵菌株报告基因本底表达所需的AbA浓度。
（1）分别挑取诱饵克隆和对照克隆，⽤0.9% NaCl重悬细胞，调节A600到0.002（⼤约2000个细胞/100 µl）。
（2）在下述培养基上分别涂布100 µl重悬后的菌液，30 ?C培养2-3 d。
SD/-Ura
SD/-Ura with AbA （100 ng/mL）
SD/-Ura with AbA （150 ng/mL）
SD/-Ura with AbA （200 ng/mL）
预期结果如下所⽰：
表1 AbA r基因预期本底表达结果
[AbA]/（ng/mL）Y1HGold[p53-AbAi]克隆数Y1HGold[pBait-AbAi]克隆数
0 约2000 约2000
100 0 Bait dependent
150 0 Bait dependent
200 0 Bait dependent
（3）在进⾏⽂库筛选时，使⽤AbA的浓度应为最低抑制浓度，或使⽤⽐最低抑制浓度稍⾼的AbA浓度（⾼约50-100
ng/mL），以彻底抑制诱饵菌株的
⽣长。
注：如果200 ng/mL AbA不能抑制本底表达，可以尝试提⾼AbA浓度⾄500-1000 ng/mL。然⽽，在不存在捕获物的情况下，如果1000 ng/mL的AbA浓度仍⽆法抑制AbA r基因的表达，那么很可能存在能够识别并与⽬的序列结合的内源调控因⼦，因⽽该⽬的序列⽆法⽤来进⾏酵母单杂交筛选。
4 ⽂库cDNA的合成
提取试材总RNA，进⾏反转录合成cDNA。合成的cDNA末端具有与pGADT7-Rec相同的酶切位点。
（1）cDNA第⼀链的合成
①准备⾼质量的poly A和/或总RNA，⽤human placenta poly A+RNA作为阳性对照。
注：RNA的质量决定⽂库的质量，RNA应为所要研究的特定时期和特定组织的RNA。
②在微量离⼼管中加⼊如下反应物：
RNA模板（0.025-1.0 µg poly A和/或0.10-2.0 µg总RNA）1-2 µl CDS III（oligo-dT）or CDS III/6（ran
dom）引物 1.0 µl Deionized H2O （使总体积达到4.0 µl）1-2 µl 总体积 4.0 µl
在另外⼀⽀管中加⼊对照cDNA反应物，即RNA使⽤1 µl（1 µg）control poly A+RNA。
③72 ?C孵育2 min。
④冰上放置2 min，轻轻混匀，⽴即加⼊步骤⑤中的试剂。
⑤每⼀个反应加⼊如下试剂，轻轻混匀离⼼。
5×first-strand buffer 2.0 µl
DTT（100 mmol/L） 1.0 µl
dNTP mixture（10 mmol/L） 1.0 µl
SMART M-MLV RT 1.0 µl
总体积 5.0 µl
注：步骤⑤中的试剂可在步骤②之前加好置于冰上。此步是cDNA合成的起始关键步骤，变性后的RNA/引物mix冰上放置的时间不应超过2 min。
⑥如果⽤的是CDS III/6随机引物，25-30 ?C保温10 min。如果⽤的是CDS III 引物，省略此步，进⾏步骤⑦。
⑦42 ?C保温10 min。
⑧加⼊1 µl SMART III oligo，充分混合，42 ?C保温1 h。
⑨75 ?C保温10 min终⽌第⼀链的合成。
⑩降⾄室温，加⼊1 µl RNase H（2 U）。
11 37 ?C保温20 min。
12 cDNA第⼀链合成产物应于-20 ?C保存，可⽤3个⽉。
（2）long distance PCR （LD-PCR）合成cDNA 第⼆链
根据合成cDNA第⼀链时使⽤的RNA量，下表给出了进⾏LD-PCR时最佳的热循环数。使⽤的热循环数越少，⾮特异性PCR产物越少。
表2 RNA量与最佳热循环数
总RNA/µg Poly A+RNA/µg 循环数
1.0-
2.0 0.5-1.0 15-20
0.5-1.0 0.25-0.5 20-22
0.25-0.5 0.125-0.25 22-24
0.05-0.25 0.025-0.125 24-26
⑴LD-PCR反应混合物中加⼊如下物质（每个样品做2个100 µl体系，对照做1个100 µl体系）：First-strand cDNA （from protocol A） 2 µl
Deionized H2O 70 µl
10×advantage 2 PCR buffer 10 µl
50×dNTP mix 2 µl
5’RACE引物 2 µl
3’RACE引物 2 µl
Melting solution 10 µl
50×advantage 2 polymerase mix 2 µl
总体积100 µl
⑵按照以下程序进⾏PCR反应：
1个循环95 ?C 30 s
X个循环95 ?C 10 s
68 ?C 6 min
1个循环68 ?C 5 min
⑶取7 µl PCR产物⽤1.2%的琼脂糖凝胶检测，检测时使⽤1 kb DNA ladder。
（2）使⽤CHROMA SPIN+TE-400柱纯化ds cDNA
⑴为每⼀个要纯化的cDNA样品准备⼀个CHROMA SPIN+TE-400柱。
⑵将纯化柱翻转⼏次，充分悬浮gel matrix。
⑶移去柱的顶盖和底盖，将柱放⼊2 ml收集管中。
⑷将柱放⼊离⼼机，700 g离⼼5 min以消除平衡缓冲液，弃掉收集管中的液体。
⑸将柱放⼊新的收集管中，把cDNA加到gel matrix的中央，切勿使样品沿柱的内壁流下。
注：加到边上易使样品沿柱内壁流下，易混有⼩⽚段cDNA。
⑹700 g离⼼5 min，纯化的cDNA收集到管中。
⑺将两个纯化的cDNA样品合并到⼀管，测量体积。
⑻加⼊1/10体积3 mol/L醋酸钠（pH5.3），混匀。
⑼加⼊2.5倍体积⽆⽔⼄醇。
⑽-20 ?C冰冻1 h。
⑾室温，14000 r/min离⼼20 min。
⑿⼩⼼弃去上清液，切勿碰到沉淀。
⒀14000 r/min瞬时离⼼，去除残留上清液。
⒁沉淀于空⽓中⼲燥10 min。
注：⼀般⼲燥⾄⽆⼄醇味，不可过度⼲燥，否则很难溶解。
⒂⽤20 µl灭菌去离⼦⽔溶解沉淀，此cDNA可⽤来进⾏同源重组构建⽂库。纯化后的cDNA⽤1%的琼脂糖电泳检测。
5 构建并筛选酵母单杂交⽂库（cDNA融合表达⽂库的构建及筛选）
（1）构建并在SD/-Leu/AbA培养基上检测Y1HGold[Bait/AbAi]菌株。
注：AbA的浓度根据构建诱饵载体时转⼊酵母抑制本底表达时的浓度⽽定。（2）按SMART technology步骤合成ds cDNA，其浓度为2-5 µg/20 µL。
（3）⽤Yeast Transformation System 2的⽅法转化酵母，在转化体系中加⼊如下物质：
①cDNA⽂库转化Y1HGold[Bait/AbAi]菌株
20 µl SMART-amplified ds cDNA （2-5 µg）
6 µl pGADT7-Rec，（Sma I-linearized）（3 µg）
②Y1HGold [53/AbAi]的转化
5 µl p53 fragment （125 µg）
2 µl pGADT7-Rec，（SmaI-linearized）（1 µg）
将转化体系分别稀释⾄1/10、1/100、1/1000、1/10000后，各取100 µl涂100 mm平板。
⽂库转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA平板，对照p53转化涂SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200平板。
（4）将剩余的所有⽂库转化混合物（约15 ml）涂在150 mm SD/-Leu/AbA平板上，每板涂150 µl。
（5）倒置培养3-5 d。
（6）3-5 d后，通过统计SD/-Leu 100 mm平板上的克隆数⽬来计算筛选的克隆数。
注：所筛选的克隆数⾄少应该达到1百万，否则会降低筛选到⽬的产物的可能性。
筛选的克隆数=[cfu/ml on SD/-Leu]×[dilution factor]×[resuspension volume（15ml）]
例如：resuspension volume=15 ml
Plating volume=100 µl
250 colonies grew on the 1/100 dilution on SD/-Leu plates
The number of clones screened=250 cfu/0.1 m l×100×15 ml=3.75 million
（7）预期结果
阳性对照试验：SD/-Leu和SD/-Leu/AbA200培养基上的克隆数相近。
⽂库筛选试验：根据SD/-Leu平板上的克隆数计算所筛选的克隆数，其结果应⼤于1百万且SD/-Leu/AbA平板上的克隆数远远少于1百万，阳性克隆数⽬取决于诱饵序列。
6 阳性克隆的鉴定及cDNA质粒的分离
（1）阳性克隆重新划线培养，进⾏表型确认
①将阳性克隆在SD/-Leu/AbA培养基上重新划线，产⽣新的单克隆。
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