BD SMART RACE cDNA Amplification Kit User Manual(Chinese)

BD SMART™ RACE cDNA Amplification Kit User Manual

Table of Contents

内容	页码
I. 概要简介
II. 成分
III. 另备物品
IV. BD SMART RACE Amplification 基本原理
V. 引物设计
VI. Poly A+ RNA 和总RNA 的制备
VII. cDNA 的第一链的合成
VIII. PCR 阳性对照
IX. cDNA末端的快速扩增(RACE)1
X. RACE 产物鉴定
XI. 疑难解答
XII. 参考文献
XIII. 相关产品
附录A: 5'-RACE 流程图示
附录B: 3'-RACE 流程图示
附录C: Suppression PCR and Step-Out PCR 39

I. 简要概述

II. 成分列表

Control Human PlacentalTotal RNA 和 BD SMART II A Oligonucleotide在–70°C下保存。

NucleoTrap Gel Extraction Kit 室温下保存。

其余试剂–20°C下保存。

随BD SMART RACE cDNA Amplification Kit 同时免费提供BD PowerScript Reverse Transcriptase和BD Advantage 2 PCR Kit。所有试剂可以满足7 次cDNA 合成反应和30次PCR反应。

First-strand cDNA 合成

•7µl BD SMART II™ A Oligonucleotide (12 µM)

5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'

• 7µl 3'-RACE CDS Primer A (3'-CDS; 12 µM)

5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'

(N = A, C, G, or T; V = A, G, or C)

• 7µl 5'-RACE CDS Primer (5'-CDS; 12 µM)

5'–(T)25V N–3' (N = A, C, G, or T; V = A, G, or C)

• 7µl BD PowerScript™ Reverse Transcriptase

• 200 µl 5X First-Strand Buffer

250 mM Tris-HCl (pH 8.3)

375 mM KCl

30 mM MgCl2

• 200 µl Dithiothreitol (DTT; 20 mM)

• 1ml Deionized H2O

5'- & 3'-RACE PCR

• 400 µl 10X Universal Primer A Mix (UPM)

Long (0.4 µM):

5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'

Short (2 µM):

5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'

• 50 µl Nested Universal Primer A (NUP; 10 µM)

5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'

Control Reagents

• 5µl Control Human Placental Total RNA (1 µg/µl)

• 25 µl Control 5'-RACE TFR Primer (10 µM)

• 25 µl Control 3'-RACE TFR Primer (10 µM)

General Reagents

• 70 µl dNTP Mix (dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, each at 10 mM)

• 2 X 1 ml Tricine-EDTA Buffer

10 mM Tricine-KOH (pH 8.5)

1.0 mM EDTA

NucleoTrap® Gel Extraction Kit (Cat. No. 636053 or K3070-y)

• 100 µl NucleoTrap Suspension

• 3 ml NT1 Buffer

• 10 ml NT2 Buffer

• 2ml NT3 Buffer

• User Manual (PT3169-1)

Free trial-size BD Advantage™ 2 PCR Kit (Cat. No. 639207 or K1910-y)

The BD Advantage 2 kit provides sufficient reagents for 30 PCR reactions.

The following components are included:

• 30 µl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix

• 200 µl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer

• 50 µl 50X dNTP Mix (10 mM each)

• 30 µl Control DNA Template (100 ng/µl)

• 30 µl Control Primer Mix (10 µM each)

• 1 ml PCR-Grade Water

• User Manual (PT3281-1)

III. 另备物品

下列试剂需另外准备：

• 0.5-ml PCR 反应管，推荐使用 PerkinElmer GeneAmp 0.5-ml reaction tubes (Cat. No. N801-0737 or N801-0180).

• Mineral oil (e.g., Sigma Cat. No. M-3516)

IV. BD SMART RACE的要点

使用前请全面阅读

•所有参数均经过优化，但可能因所使用的酶、模版、引物和热循环仪而不同。因此应使用Control Human Placental Total RNA和Control 5'- and 3'- RACE TFR Primers进行预实验。

•RACE PCR的效率取决于试验样品RNA中mRNA的丰度。另外退火温度和延伸温度也依引物不同而变化。请参照第X节的建议优化PCR的条件。

•在进行5'-RACE and 3'-RACE PCR时必须使用热启动。本手册已经过优化，所使用的BD Advantage 2 Polymerase Mix中包含BD TaqStart 抗体用于自动进行PCR的热启动 (Kellogg et al., 1994)。也可以手动(D’Aquila et al., 1991).或使用蜡珠(Chou et al., 1992)来进行热启动。

•推荐使用试剂盒中提供的Tricine-EDTA缓冲液稀释和重悬DNA样品。Tricine缓冲液在高温下较Tris-based缓冲液有更好的缓冲能力。Trisbased 缓冲液会导致pH降低，引起DNA的降解。

•整个过程要戴手套以防核酸酶污染。

• 重悬过程（包括吸入和吹出溶液）要轻缓，短暂离心使所有成分聚集管底。

• 无特别标示，所有操作均应在冰上进行。

• 聚合酶在最后加入。

• 使用推荐的酶加入量，该量已经过特别的优化。

• EB是致癌物质，小心处理和使用。

V. 引物设计

A. 引物序列

特异引物(GSPs) 应当：

• 23–28 个核苷酸

• GC含量为 50–70%

• Tm 大于或等于65°C，如果Tm >70°C可获得最好的结果 (可使用降落PCR)。

模版、引物及RACE产物如图3所示。至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5'-RACE PCR的反义引物和用于3'-RACE PCR的正义引物。如果只进行5'- 或3'-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。

如图race实验3所示，两种引物的5'- and 3'-RACE扩增产物存在部分重叠，如果在重叠区有一个合适的限制性酶切位点，可以通过酶切和连接反应可以得到cDNA的全长。将两个引物设计成其RACE产物有100–200-bp的重叠的形式，就能够配合使用作为PCR反应的阳性对照。引物并非一定要设计成获得重叠片断的形式。对于大或稀有cDNAs，引物最好要设计的尽量靠近cDNA的末端，不产生重叠。此外，引物自身可以重叠（如互补）。

特异引物GC含量为50–70% ，其至少 65°C。使用nearest neighbor 分析 (Freier et al., 1986; 我们使用Primer Premier软件来计算Tm’s) Tm.应尽可能大于70°C。根据我们的经验，长引物的退火温度高于70°C特别从困难的样品中可以得到强的RACE扩增。 Tm’s 超过70°C 可以使用降落PCR。此外GSP1和GSP2设计成具有相似的Tm’将更有利于使用。通过计算或试验能够得到GSP1和GSP2的Tm’s。要避免使用内部互补的引物或引物之间互补的引物，尤其在引物的3'末端互补。

注意：不要将酶切位点都合并到5'和3'特异引物的5'末端，根据我们的经验，这些额外的序列将会增加反应的背景。

Figure 3. The relationship of gene-specific primers to the cDNA template.

B. 引物在基因上的位置

尽管我们使用BD SMART RACE Kit成功地得到了大于6.5 kb扩增产物，但为了使你的5'-和3'-RACE 产物达到2 kb，建议对引物加以筛选。

C. 降落PCR

我们发现降落PCR (Don et al., 1991; Roux, 1995)明显增加BD SMART RACE扩增的特异性。降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。如果你的特异引物

Tm，在这些循环中将只有与基因特异性结合的引物发生聚合，从而积累一定量的特定产物。退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。

本文发布于:2024-09-21 16:40:53，感谢您对本站的认可！

本文链接：https://www.17tex.com/tex/2/378961.html

上一篇：安徽省淮北市实验高级中学2022-2023学年高一上学期1月期末英语试题_百 ...

下一篇：山西省实验中学高一英语下学期第一次月考试题