Ap/i 2221VoU41 No
2221年 4月 第41卷第4期
基础医学与临床
Basic & Clinical Mediciuv
文章编号：14416325(2421 44-055/07
研究论文
杨萍，代天，张苏川
(江汉大学附属医院(武汉市第六医院)心血管内科，湖北武汉93001)
摘要：目的研究当归多糖(APS )对大鼠心肌细胞系H9c2增殖和凋亡的影响。方法将大鼠心肌细胞系H9c2分
为对照组(coxRO 组)、阿霉素(ADR )诱导H9c2细胞复制扩张性心肌病心肌细胞组(ADR 组)、APS 干预(APS 组)、转染 anti-miR-NC(APS+artWmiR-NC 组-及转染 anti-miR-47413p( APS+arti-miR-47413p 组-。采用流式细胞
计量术检测细胞凋亡‘Western blvt 检测B 细胞淋巴瘤/白血病-7( Bcl-2) , Bcl-2相关X 蛋白(Ba )、细胞核相关抗原
Ki-67(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA )蛋白表达，酶联免疫(ELISA )法检测B 型脑钠肽(BNP )水平，细胞计数试
剂盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖，实时定量PCR( RT-qPCR )检测微小RNA-0741-3p ( miR-4741-Cp )表达。结果阿
霉素明显提高H9c2细胞的BNP 含量、细胞凋亡率、Ba 蛋白水平，显著降低BU-2蛋白表达量(P<0.45)o 当归多
糖明显增加阿霉素诱导后H9c2细胞的细胞活力、Ki-67、PCNA 、BcU2蛋白表达量和miR-0741-3p 表达量，显著减少 细胞的凋亡率、Ba 蛋白表达量(P<4. 45)。敲减miR-0741-Ch 明显降低当归多糖作用
的扩张性心肌病H9c2细胞
的细胞活力、Ki-67、PCNA 、BcU2蛋白水平，而显著提高其凋亡率、Bap 蛋白表达量(P</45)。结论当归多糖通过 上调mW-47413p 的表达，促进阿霉素诱导的扩张性心肌病大鼠心肌细胞系H9c2增殖。
关键词：阿霉素；细胞系H9c2；miR-47413p ；B 型脑钠肽
中图分类号:R592.5
文献标志码:A
Angelico holysaccgariUc promotof tPc hroliferatiox of rat cordiomyocyto boo H5c2
YANG Ping , DAI Tian , ZHANG Su-chuau
(DepaXment vf Cardiovasculas MedRioc , the Affiliated Hospital vf Jianghao University (Wuhao Sixth Hospital) - WuPao 43601, China)
Abstrect : 0bjective To sWpy the effect of angelica polysacchaOXv on pmliferatiou ad apoptosis of mt cardiomyo
cyte Unv H9c2. Methods Rat curdiomyocyte H9c2 was diviXed into a control gmup ( Control gmup - , doxoApicin (ADR) induced H9c2 cell AplUpWo dilated cadWmyopphy cardiomyocyte aroup (ADR aroup) , APS intemextiox (APS gmup ) , transfection anti-miR-NC (APS +an/-miR-NC gmup - and transfected an/-miR-7721-3q (APS+anti-
miR-7721-3q aroup -. Flow cytomety was ayp/ed to detemiov apoptosis , Westex blot was employed to test B cell
lympPomamdUemix-q( Bct-2) , Bct-2 related X protein ( Bao) , nuemar related antigen Ki -79( Ki -79- and pmlifera-
tiox cell nuemar antigen (PCNA) protein expression , enzyme-Onbed iwmuuopsay (ELISA) method was used to de
tect B-type brain natwuretic pep/Xv (BNP - level. Celt pmliferatiou was detected by commercial-e available kit 3
(CCK-5) , and real-time quantitative PCR (RT-qPCR) was used to aPyze the micARNA-P721-3q(miR-P721-3q) expression. Resuas Ad/amycin significatly increased BNP coxteot , apoptosis r
ate , and Bao protein Uvei in H9c2 ceb/ and greatly reduced Bct-2 protein 2pmssWx(Pv0. 05) . Angelicu polysac-cUa/Xv odviously iucreased
收稿日期：2024- 09-04 修回日期：2024- 03-11
* 通信作者(creespoiidRg author ) : zhangsuchmul@ 178
552基础医学与临床Basic&C/nicai Medicine266801(4)
H9c2cell viakilite,Ki-27,PCNA,Bci-2potein expression and miR-2771-3p expression aher doxoru/icin induction, and omoddPly reb/ced cell apoptosis and Bax potein expression(P<0.09).KnocUdowa of miRN701Np signific—tly reb/ced the cell viaPility,Ki-27,PCNA,and Bci-2potein levels of dilated cardiomyopatUe H9c2cells treated with anpe/ca polysaccUaOde ,while signific—tly incoxs—Os apoptosis rate and Bax potein expression(P< 0.09).Conclusions Anpe/ca polysaccUahde up-regulates the expression of miR-2771-3p,promotes the poPferaUon of dkrOmycbLnd/c—rat cardiomyocyte line H9c2.
Key woels：—O—ipcin；cell/no H9c2；miR-47416p；BNP
扩张型心肌病(dilated cyigOmyopOhy)是一种严重的疾病，特征是心室扩张和心脏功能障碍。作为人
类最常见的心肌病形式，扩张型心肌病约占所有心肌病的66%，也是心力衰竭和心脏移植的主要原因［表］。现阶段，扩张型心肌病的临床尚未获得令人满意的结果，并且患者的预后极差，其5年生存率低于56%［'^o因此，有必要进一步开发新的策略来改善扩张型心肌病。当归是一种常用的中药，具有造血、抗氧化、抗感染、免疫调节、抗细胞凋亡和抑制血小板聚集的药理活性［5：。当归多糖(—pUma uolyspccUahne,APS)是从当归根中提取的主要的水溶性成分，可以通过激活化转录因子6(activating transcoption factcr-2,ATF6)减轻内质网应激诱导的大鼠心肌细胞系H9c2凋亡，从而保护心脏免受缺血性损伤⑸。当归多糖还能以浓度依赖方式减少缺氧-复氧诱导的H9c2心肌细胞凋亡，改善细胞的氧化应激损伤⑷。但是，目前尚无有关当归多糖对扩张型心肌病影响及机制的报告。微小RNA(m0oRNA,miRNA)-47716p是重要的miRNA 之一，其调节功能已在各种癌中被报道⑺。既往研究表明，miR-47016p在扩张性心肌病患者中相较于正常对照高表达⑻。但是,miR-27716p是否参与当归对张心肌病心肌的
不清楚。因此，本研究以大鼠心肌细胞H9c2为对象，利用阿霉素(akhamecin,ADR)诱导心肌细胞损伤，模拟扩张型心肌病，评价当归多糖在细胞增殖和凋亡中的功能及潜在分子机制。
1材料与方法
1.1细胞系与试剂
鼠源H9c2细胞系(中科院上海细胞库)，当归多糖APS(Solardie公司)；ADR(辉瑞制药有限公司)；Dulbecco's MobiheP Eagle's Medium(DMEM)培养基(Gi/ca公司)；a/i-miR-q7016p及阴性对照anti-miR-NC(8州锐博公司);B型脑钠肽(B-type nat/nretic peptbe；BNP)酶联免疫(ELIA)试剂盒(北京华英生物技术研究所)；Annexin V-CITC/TI 双染细胞凋亡检测试剂盒(BehBO公司)；抗B细胞淋巴瘤/白血病表(B cell lymphoma/mwkmb-2, Bci-2)、抗Bci-2相关X蛋白(Bci-2associated X pratein,Bax)、抗细胞核相关抗原Ki-67(nucmar associated antipex Kb7,Ki-67)、抗增殖细胞核抗原(proliferating cell nucmar antipex,PCNA)抗体(Abeam公司)；实时定量PCR(q/anStahva real-time PCR,RT-qPCR)相关试剂盒(TaKaRa公司)。
1.2方法
80.1细胞培养、分组与处理：用含(％胎牛血清和1%青链霉双抗的DMEM培养基，在饱和湿度、37C和6%CO s的细胞培养箱中常规培养H9c2细胞。将H9c2细胞分为对照组(control组)、ADR诱导H9c2细胞复制扩张性心肌病心肌细胞组(ADR 组)。当归多糖(angelica uolyspccUaOne；APS)干预(APS组)、转染anS-miR-NC(APS+anS-miR-NC组)及转染anti-miR-2771-3p(APS+anti-miR-2771-3p 组)o转染时按照Lipofectamine2000转染试剂的步骤，在细胞汇合至66%的H9c2细胞中转染anti-miR-47016p和anti-miR-NC，根据分组进行其他处理。其中,10/01组为正常培养的细胞,ADR组用3mg/L ADR作用H9c2细胞19h,APS组用252mg/L 当归多糖预处理细胞24h，之后进行ADR损伤, APS+anB-miR-NC组或APS+
anB-miR-47016p组细胞转染anti-miR-NC或a/WmiR-47016p，使用252mg/L当归多糖处理24h后，进行ADR损伤。80.0流式细胞计量术检测细胞凋亡：收集各组H9c2细胞，用冷磷酸盐缓冲液洗涤2次，在400
结合缓冲液中悬浮细胞，将细胞浓度调整为1X104
杨萍当归多糖促进大鼠心肌细胞系H9c2增殖
553
个/mL 。之后加入5 r L Annexis VWIBC ，轻轻混匀
后于4 C 避光反应1 min，加入1 r L PI 并轻轻混
匀，于4 C 避光反应5 mix , 进行细胞凋亡分析。
1.2.3
Western SU-检测 BcU2、Bax 、Ki-67、PCNA 表达：向各组H9c 2细胞中加入RIPA 裂解液，进行 蛋白的提取。将提取的蛋白于沸水中变性12 mb ,
并吸取36 R g 进行12%的SDSWAGE 电泳，转膜。
用5%脱脂奶粉封闭液封闭，之后与抗Bct-2、抗
Bax 、抗 Ki-67、抗 PCNA 和抗 0 肌动蛋白((3-actin )
一抗，在4 C 条件下孵育过夜。第2天，将膜与辣根
过 物酶标记的羊抗兔PG 一起孵育2 h，再通过 ELC 化学发光液显、显影，通过Image J 软件分析
BctW 、Bax 、KiW2、PCNA 蛋白的水平。
1.2.2 ELISA 法检测BNP 水平：构建扩张性心肌
病大鼠心肌细胞模型时，收集cont/l 组和ADR 组
H9c2细胞上清液，按照ELISA 试剂盒的说明，检测 BNP 。
1.2.0 CCIK8法检测细胞增殖：收集各组H9c2细
胞，以1><109个/孔的数量接种于92孔板，向培养
48 h 后的细胞中加入1 r L CCK-8溶液，孵育1 h ,
于酶标仪测定细胞在454 nm 波长处的吸光度M 值,
活力。
1. 2.2 RT-qPCR 检测miR-2771-36表达：收集各组
H9c2细胞，加入Tdzoi 试剂 RNAo 通过
PdoeOcdpt™ RT 试剂盒进行反转录，得到cDNA 。
通过SYBR Premia E x Tap 试剂盒进行PCR 反应。
miRW701Wp 的表达以U6 ：
，由2-AACt 方法计
算得出。miR-2771-36引物序列为5'WCACCACAC
CTACCCCTTGTW' ( F )和 5，淀CACCACACCCATCAC
CCATW ，( R ) U6 引 物序列为 5'WTGGTAGGGT GCTCGCTTCGGCAGW' (F )和 5,- C A A C T GGTGT C
GTGGAGTC G GC - 3'(R )。1.2统计学分析
用SPSS 22. 0软件进行统计和分析，结
果以 土标准差(丘土s)表示。两
较采用t 检
验6 较采用单因素 分析6 重比较
采用SNK-y 检验。
2结果
2.1阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9c2凋亡
与对照组比较，ADR 组H9c2细胞中BNP 含
量、细胞凋亡率和Bax 蛋白水平显著升高，而Bcl-2
蛋白
(P<0.05)(图 1)o
control
10410410° 101 102 103 104
annexin V-FTTC
10°
103
K io 2
ADR
101
10°
• ：V
■ | 11 j 111 j 1111111 111111
101 102 103 104 aimexin V-FTTC
-□ADR BAPS control ADR ku
O B
ri
SISOKodp
control ADR .O 09.64.2O 1.0.0.0.0.u .2s s a l d x
<u
up-OJdoAH&Ial
Bcl-2
Bax
C
(TUI/
bi3
d)/SPA2
艺工
B
A. tow cytomet/ to detect cell apopUsis ；
B. Western Slot to deUct the rela/ve expressiov of Bcl-7 and Bn proteis ;
卩＜2. 45 compared with costrol group
图1阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9c2凋亡
Fio 1 Adriamydn-inducen apoptosis of rai c21'dRmyocytr
H9c2
554基础医学与临床 Basic & Clinical Medicibv 222/6/4)
2. 2当归多糖对扩张性心肌病大鼠心肌细胞H9c2 增殖的影响与ADR 组比较，APS 组H9c2细胞的Ki-69、
PCNA 蛋白 升高，细胞活力 增加
(P<9. 05)(图 2)o
2. 2当归多糖对扩张性心肌病大鼠心肌细胞H9c2
凋亡的影响与ADR 组比较，APS 组细胞的凋亡率显著降
低,Bct-2蛋白表达量明显增加，Bax 蛋白表达量显
著减少(P<9. 05)(图3)o
2. 2当归多糖对miR-4701-3p 在扩张性心肌病大
鼠心肌细胞H9c2中表达的影响
APS 组H9c2细胞中miR-7721-3q 表达量为 /62±0. 40，显著高于 ADR 组的 /62±2.29(P < 2225)。
2.2敲减miR-3701-3p 对当归多糖作用的扩张性
心肌病大鼠心肌细胞H9c2增殖的影响
与 APS 组比较,APS+an/-miR-AC 组细胞 H9c2
的Ki-69、PCNA 蛋白表达量、细胞活力、miR-7721-3q
表达量无明显变化;APS+antXmiR-47913p 组H9c2
Ki-67
359
PCNA 29
p-actin
42
ADR APS ku
A. MTT deWcWd cell viabi/tp ；
B. Western blct to deWot the relative expmssiox Ki-67 and PCNA protein ; *P </ 45 com pared with ADR group
图2当归多糖对扩张性心肌病大鼠心肌细胞H9c2增殖的影响
FR 2 EffeC of angelicc polysaccharinr on the ecpression of H9c2 peUferation-relateP petein in dilated
C2rdiomyopathy ets
Bcl-2Bax
p-actin 104103102
101
10°
«• •• •
ADR
10° ' IO 1 ' IO 2 ' IO 3 ' 104
ADR APS ku
2621
42
annexin V-FTTC
A. Uow cytometry to detect cell apoptosis ；
B. Western blct to deWot the relative expmssiox of Bcl-2 and Ba protein ;
*P<2. 45 compared with ADR group
图6当归多糖对扩张性心肌病大鼠心肌细胞H9c2凋亡的影响
FiR 6 Effect of angelicc polysaccharinr on c2eRmyyc2tr H9c2 apoptosis in dilateC cceRmyypathy
ets
杨萍当归多糖促进大鼠心肌细胞系H9c2增殖
555
细胞内Ki-27,PCNA 蛋白水平明显降低，细胞活力
显著降低,miRT701-3p 表达量明显减少（P<0. 05）
（图 4）o
2.6敲减miR-5701-5p 对当归多糖作用的扩张性
心肌病大鼠心肌细胞H9c 2凋亡的影响
与 APS 组比较,APS+anB-miR-NC 组细胞 H9c2
的凋亡率'BciN'Bap 蛋白水平无显著变化；APS +
anS-miR-4701-3p 组细胞H9c2的凋亡率明显增加， Bct-2蛋白
减少，Bax 蛋白表达量明显升
高（P<0. 05）（图 9）o
3讨论
现阶段，扩张型心肌病的病因和发病机制仍不
清楚。本研究采用 素 心肌 H9c2
损伤，以构建扩张型心肌病模型⑼，结果发现，阿霉
素的使用导致心肌细胞H9c 2的凋亡率和促凋亡蛋
白Bax 的蛋白表达量增加，抗凋亡蛋白Bct-2的蛋
白表达量减少，并且，细胞中BNP 升高，与报道［1461］相符，因此，后续实验在此模型的基础上探 讨当归
的作用和 。
当归 心脏疾病方面表现出一定的预防和
作用，例
-复 致H9c 2心肌细胞凋亡
增加，而当归
可以
减少其凋亡，产生保护缺
-复氧损伤心肌细胞的效果［14：o
条件下,
当归多糖的预处理通过下调miR-26的表达，促进细 增殖和抑制细胞凋亡，从而减轻H9c2 损
［I5：o 然而，当归 对 素损 心肌
uasaH9c2的保护作用尚未得到充分 。本实验中，当
归多糖可以增加阿霉素诱导后H9c2细胞的 活 力，并减少 的凋亡，提示当归多糖可能对 素
的大鼠心肌
H9c2损伤发挥保护和
用。
以前的研究证明了 miR-4701-3/在扩张性心 肌病患者中高表达⑻。结直肠癌HCT116中的 miR-4701 Dp 被异恶卩坐衍生物SHU06635显著下
调,miR-4701-3p 可以逆转 SHU00235 对 HCTl-细
u.sssaldxo
d
co v
I O 卜
7晴
QAy&Ial
(u n i
o g
—
o n N A
y
.5.O .5.O .5O 2 21.1
.O.
u.sssaldxoIipjO-ldoAHEIal
Ki-67PCNA
p-actin
■ APS+anti-miR-NC
□ APS+anti-miR-4701-3p
5
O
Ki-67 PCNA
c
As qRT-BCR deOcOb the expression of miR-4741-3p ； B. MTT deOcted cell viaki/ty ; C. Western blot O deOct the rem-
Sve expression of Ki-67 and PCNA protein ; *P <4. 45 compared with APS goup
图4敲减miR1701・3p 对当归多糖作用的扩张性心肌病大鼠心肌细胞H9c2增殖的影响
Fio 4 Effel of knochdown of miR-4701-3p on the ecpression of H9c2 praliferahon-related pratein
Os cardiomyocytes of dilateC cardiomyspathy rats trected with angelica
polysacchariOcs
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