DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答

李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）

（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evidence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297

【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：

水溶性抗氧化剂

	DPPH•自由基	ABTS+•自由基	PTIO•自由基
结构式
简单表达式	DPPH·	ABTS·+	PTIO·
分子式与分子量	C18H12N5O6; M.W. 394.3	C18H24N6O6S; M.W. 548.68	C13H17N2O2; M.W. 233.3
带电情况	中性自由基	阳离子自由基	中性自由基
种类	氮自由基（成单电子在N原子上）	氮自由基（成单电子在N原子上）	氧自由基（成单电子在O原子上）
外观	紫黑粉末	没有纯的ABTS·+	紫褐粉末
溶解性与溶液颜	溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）溶液呈紫，浓度越高，颜越深	溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）、水以及水性的缓冲液溶液呈墨绿，浓度越高，颜越深	溶于水以及水性的缓冲液溶液呈蓝紫，浓度越高，颜越深
CAS号	1898-66-4	无	18390-00-6
工作液配制方法	将已购的DPPH自由基粉末，溶解即得其工作液	将已购的ABTS二铵盐[(NH4)2ABTS]与过二硫酸钾(K2S2O8)黑暗中反应12小时后，再稀释得其工作液。	将已购的PTIO 自由基粉末，溶解即得其工作液
工作液外观	紫	墨绿	蓝紫
工作液紫外光谱与最大吸收	(50 μg/mL)	（0.07mM (NH4)2ABTS+0.03mM K2S2O8）	(50 μg/mL)
检测波长	519 nm	734nm	557nm（水溶液）
检测原理	当A519 nm值减少，表明DPPH·被清除。其清除机制主要是氢转移HAT (hydrogen atom transfer)	当A734nm值减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子转移ET (electron transfer)	当A557减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子移ET (electron transfer)加质子转移PT (proton transfer)
用途	主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。	主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。	主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。通过调节缓冲液的pH值，可以检测其抗氧化机制。
优势	清除速度较快，约30分钟（室温下）。	清除速度较快，约6分钟（室温下）。	（1）水溶性好，与生物相关性强；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS清除水平；（3）抗氧化机制明确：pH值小于5.0时，为电子转移ET机制。当调节pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH值有关，也就是说与氢离子（质子）浓度有关，据此，可证明其涉及PT机制。
局限性	（1）只能在有机溶剂（如甲醇、乙醇）中进行，不能在水溶液中进行；也不能在缓冲液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。	（1）不能在缓冲液中进行。当然，可以在有机溶剂（如甲醇、乙醇）和水溶液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）配制工作液需要的时间长（约12小时）（4）ABTS·+与(NH4)2ABTS、K2S2O8共存于溶液中，无法单独分离。所以，会导致无法预期的干扰。	清除反应速度较慢，约2小时完成。不过，如果出现这种情况，可以适当加热（如37℃、50℃），或延长反应时间。
所需仪器	可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）	可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）	可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）

【实验讲解】

1.DPPH•自由基清除实验[1]

1.1 DPPH测试液的配置

取DPPH固体1mg溶于24mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。最好避光保存，5小时内用完。取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL 95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。

1.2 样品液的配置

样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。

1.3 预试

取DPPH溶液1.0 mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪情况，当溶液颜基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到500 μL时，DPPH溶液颜基本褪去，则500 μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100 μL、200 μL、300 μL、400 μL、500 μL。

A0值：取DPPH溶液1.0 mL到比皿中，加对应有机溶剂0.5 mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。

A值：取（500-x）μL 有机溶剂到比皿中，加样品液 x μL （x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0 mL，混合使反应液总体积为1.5 mL。测A值。

【如】某样品的用量梯度为100 μL、200 μL、 300 μL 、400 μL、500 μL，则加样如下：

样品液	95乙醇（或无水乙醇）	DPPH测试液	总体积
0μL 100μL	500 μL 400 μL	1.0 mL 1.0 mL	1.5 mL 1.5 mL
200μL	300 μL	1.0 mL	1.5 mL
300μL	200 μL	1.0 mL	1.5 mL
400μL	100 μL	1.0 mL	1.5 mL
500μL	0 μL	1.0 mL	1.5 mL

1.4 最终测量

每测一个用量需要测三个平行数据。

1.5 DPPH•清除率（抑制率）的计算

(A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。)

1.6 使用注意事项

1.6.1测量前，要先用空白溶剂调零。

1.6.2将溶液注入比皿后应当充分摇匀，使颜均匀分布。

1.6.3每次使用前后要注意比皿的清洁。

1.6.4如果在实验过程中出现A值大于A0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所

致，此时，应该减去本底吸收的A值(A本)。这个A本值可以通过，加样品但不加DPPH的方法测得。此时的计算公式为：

1.7疑难解答

问：DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么？

答：DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在519nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫的特性。当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，溶液颜减淡，其褪程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。

问：DPPH自由基被清除的机制是什么？

答：DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟

基氧杂蒽酮为例）：

问：实验中的溶剂应该怎么确定？

答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？

答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数

值，实验中要根据预试结果进行调整。由于1 mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。

问：测量完成后怎么计算IC50？

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